Nghiên cứu về quá trình làm trong của dịch lên men mật độ cao của vi khuẩn Escherichia Coli tái tổ hợp
Để giảm sự can thiệp của chất lỏng vật liệu vào sắc ký và cải thiện khả năng thu hồi protein mục tiêu, quá trình làm trong dịch phân hủy lên men mật độ cao của hai chủng Escherichia coli tái tổ hợp đã được nghiên cứu. Các chủng BL21-HP1036 và BL21-palA biểu hiện các gen chính của Streptococcus suis và Haemophilus parasuis đã được chọn. Quá trình dòng chảy tiếp tuyến, quá trình ly tâm tốc độ cao và quá trình làm trong băng màng đã được sử dụng để đánh giá sản lượng protein bằng cách phát hiện độ đục và điện di.
Kết quả cho thấy dịch ly giải lên men mật độ cao BL21-HP1036, BL21-palA biểu hiện các gen chính của Streptococcus suis và Haemophilus parasuis đã được làm trong bằng phương pháp lọc màng và ly tâm, năng suất protein đạt trên 80%, có thể giảm hiệu quả nhiễu sắc ký và cải thiện tỷ lệ thu hồi.
Giới thiệu
Hiện nay, Streptococcus suis (SS) và Haemophilus parasuis (HPS) là những tác nhân gây bệnh do vi khuẩn phổ biến nhất trong các trang trại chăn nuôi lợn, gây ra tổn thất lớn cho ngành chăn nuôi lợn. SS có thể được chia thành tổng cộng 35 huyết thanh nhóm 1-34 và 1/2, và HPS có thể được chia thành các huyết thanh nhóm 1-15, và hai loại này thường lẫn lộn, chủ yếu gây ra viêm đa thanh mạc ở lợn, viêm khớp, viêm màng não, viêm nội tâm mạc, nhiễm trùng huyết do vi khuẩn và viêm phế quản.
Do số lượng huyết thanh của Streptococcus suis và Haemophilus parasuis rất lớn nên khả năng bảo vệ chéo giữa các huyết thanh khác nhau rất yếu, khi điều trị bằng kháng sinh sẽ làm tăng đáng kể tình trạng kháng kháng sinh, ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị.
Vắc-xin đã trở thành một trong những biện pháp hiệu quả để phòng ngừa SS và HPS. Có vắc-xin bất hoạt, vắc-xin giảm độc lực, vắc-xin sống, vắc-xin tiểu đơn vị và vắc-xin biến đổi gen, nhưng vắc-xin bất hoạt và vắc-xin giảm độc lực chủ yếu có trên thị trường và khả năng bảo vệ miễn dịch của chúng tốt, nhưng khả năng bảo vệ chéo không rõ ràng. Vắc-xin tiểu đơn vị là một loại vắc-xin mới chống lại liên cầu khuẩn suis, là một loại vắc-xin mới có khả năng bảo vệ chéo mạnh và giá thành thấp. Việc nghiên cứu và phát triển vắc-xin tiểu đơn vị của Streptococcus suis và Haemophilus parasuis cung cấp một giải pháp hoàn hảo cho các vấn đề phòng ngừa và kiểm soát Streptococcus suis và Haemophilus parasuis đang hoành hành trong ngành chăn nuôi lợn ở Trung Quốc.
Vắc xin tiểu đơn vị Streptococcus suis và Haemophilus parasuis được lên men mật độ cao bằng Escherichia coli tái tổ hợp. Làm trong dịch phân hủy có tác động lớn đến năng suất protein mục tiêu, nhưng có ít báo cáo liên quan. Làm thế nào để thực hiện bước làm trong của quá trình lên men và tinh chế là một công việc quan trọng. Trong bài báo này, E. coli BL21-HP1036, BL21-palA tái tổ hợp lên men mật độ cao làm mục tiêu, để nghiên cứu cách giảm hiệu quả độ đục của dung dịch làm trong, cải thiện năng suất protein, để quá trình lên men vắc xin tiểu đơn vị Streptococcus suis đạt được công nghệ nghiền và làm trong công nghiệp nhằm cung cấp cơ sở lý thuyết và hỗ trợ kỹ thuật.
1. Vật liệu và phương pháp
1.1 Vật liệu
1.1.1 Các chủng
Các chủng Streptococcus suis và Haemophilus parasuis BL21-HP1036, BL21-pa-lA
1.1.2 Phương tiện chính và thuốc thử
Chiết xuất nấm men và cá heo; Natri clorua; Kanamycin, IPTG; Formaldehyde từ; Bộ gel SDS-PAGE.
1.1.3 Thiết bị thử nghiệm chính
Máy lên men mật độ cao; Máy ly tâm tốc độ cao; Thiết bị điện di; Hệ thống hình ảnh gel cực tím; Máy nghiền siêu âm; Máy ly tâm tốc độ cao nhỏ; Máy quang phổ cực tím; Bàn lắc nhiệt độ không đổi; Thiết bị sắc ký ái lực.
1.2 Phương pháp
1.2.1 Nuôi cấy lên men mật độ cao
Các chủng coliform tái tổ hợp đủ tiêu chuẩn BL21-HP1036 và BL21-pa-lA được cấy vào môi trường tổng hợp ở nồng độ 2%(V/V) và nuôi cấy ở 37 độ trong 35-40 giờ.
1.2.2 Biểu hiện cảm ứng protein tái tổ hợp
Khi dung dịch lên men OD{{0}}±0.1, quá trình cảm ứng bắt đầu, nhiệt độ cảm ứng là 35 độ ±0,5 độ và quá trình nuôi cấy kết thúc sau 10 giờ cảm ứng.
1.2.3 Nghiền đồng nhất áp suất cao và ly tâm
Chất lỏng vi khuẩn đã qua thử nghiệm bất hoạt được nghiền bằng máy đồng nhất áp suất cao để tách tế bào tương ứng, với áp suất 100~150 MPa. Sau khi nghiền, chất lỏng đã nghiền được giữ ở nhiệt độ thấp.
Phần dịch trong thu được bằng cách ly tâm với tốc độ cao, tốc độ ly tâm: 15000 vòng/phút, kiểm soát nhiệt độ: 10 độ ~15 độ, tốc độ tiêm: 0,5~1 L/phút, phần dịch trong thu được và phần dịch trong được đổ đầy các thùng chứa đã loại bỏ nội độc tố.
1.2.4 Lọc tinh băng màng vi lọc
Màng được rửa bằng 10L nước tinh khiết theo một hướng và tiến hành lọc dòng tiếp tuyến. 300 mL huyền phù vi khuẩn bị phá vỡ sau khi ly tâm được lấy từ máy ly tâm đường ống và được làm trong bằng băng màng vi lọc 0,45um. Độ đục được đo bằng cách lấy mẫu tương ứng và độ đục sau khi ly tâm, độ đục của chất lỏng đã làm trong trong băng màng vi lọc và độ đục của chất lỏng cô đặc trong băng màng vi lọc được so sánh. Hàm lượng protein của mẫu được phát hiện bằng sắc ký và điện di để đánh giá năng suất protein.
Bước 2: Kết quả
2.1 Dữ liệu làm rõ và kết quả thử nghiệm của protein BL21-HP1036 và BL21-palA
Kết quả trong HÌNH 1 cho thấy độ đục của chất lỏng nghiền Escherichia coli tái tổ hợp BL21-HP1036 và BL21-palA giảm từ 4 500 NTU và 4 000 NTU xuống còn 1970 NTU và 520 NTU sau khi ly tâm ống. Độ đục của Escherichia coli tái tổ hợp BL21-HP1036 và BL21-palA giảm xuống còn 25 NTU và 1,28 NTU bằng phương pháp băng màng vi lọc. Có thể thấy rằng việc sử dụng lọc dòng tiếp tuyến băng màng vi lọc và kênh dòng mở được tối ưu hóa có tác dụng tốt trong việc giảm nội độc tố, độ nhớt và độ đục của chất lỏng sắc ký so với phương pháp lọc ly tâm truyền thống và có thể làm giảm đáng kể heteroprotein E. coli tái tổ hợp bị phá vỡ và axit nucleic.
2.2 Phục hồi protein của mẫu BL21-HP1036 và BL21-palA
Bảng 1 cho thấy protein Escherichia coli BL21-HP1036 tái tổ hợp tồn tại trong cả dung dịch đã được lọc vi mô và dịch nổi cô đặc được bao phủ bởi màng lọc vi mô, và tổng sản lượng protein sau khi thu hồi protein từ dung dịch đã được lọc vi mô và dịch nổi cô đặc là khoảng 88,5%. Protein BL21-palA cũng tồn tại trong dung dịch đã được lọc vi mô và dịch nổi của dung dịch cô đặc được bao phủ bởi băng màng lọc vi mô. Tổng sản lượng protein BL21-PALa là 81,5%.
3. Kết luận
Trong bài báo này, các chủng biểu hiện gen chính BL{{0}}HP1036 và BL21-palA của Streptococcus suis và Haemophilus parasuis lần lượt trải qua quá trình lên men mật độ cao và đạt 0,45 Độ đục của chất lỏng vật liệu được giảm đáng kể nhờ quy trình băng màng vi lọc um, cho thấy công nghệ lọc dòng tiếp tuyến với băng màng vi lọc tốt hơn so với công nghệ ly tâm tốc độ cao và có thể làm giảm đáng kể protein tạp chất và axit nucleic của Escherichia coli tái tổ hợp bị phá vỡ.
Sau khi thu thập chất lỏng trong suốt trong băng màng vi lọc đơn, có 62,9% Vì 37,1% protein mục tiêu của BL21-HP1036 là chất cô đặc vi lọc hoặc tồn tại trong băng màng vi lọc và các tổn thất khác, nên phương pháp hai bước đã được áp dụng để làm trong. Ở bước đầu tiên, băng màng vi lọc 0,45um được sử dụng để làm trong và thu thập dịch tiết; ở bước thứ hai, chất lỏng cô đặc còn lại được thu thập sau khi ly tâm ống và chất lỏng đã làm trong hai bước được kết hợp làm mẫu sắc ký. Giá trị độ đục của chất lỏng lên men BL21-palA không tăng đáng kể, năng suất protein có thể đạt hơn 85,5% và năng suất protein của chất lỏng lên men BL21-Pala có thể đạt 81,5% sau khi xử lý hai bước.
Về cách chọn băng màng vi lọc, Guidling Technology có thể cung cấp cho bạn các giải pháp chất lượng cao. Các sản phẩm băng màng vi lọc và băng màng siêu lọc của chúng tôi sử dụng polyether sulfone làm chất mang, được thiết kế đặc biệt cho công nghệ sinh học. Màng polyether sulfone của chúng tôi có các ưu điểm là thông lượng cao, hấp thụ protein thấp, độ bền cơ học cao, khả năng chống va đập, v.v. Chúng tôi cung cấp cho bạn các kẹp màng đặc biệt để đo áp suất của đầu vào và đầu ra theo thời gian thực và có thể cung cấp các chuyến thăm kỹ thuật theo nhu cầu của bạn để tùy chỉnh hệ thống siêu lọc/vi lọc đặc biệt của bạn. Một hệ thống dòng chảy tiếp tuyến nhỏ như vậy có thể được sử dụng cho sản xuất quy mô nhỏ, thí điểm và quy mô nhỏ và có thể khuếch đại tuyến tính hoàn toàn để đáp ứng đầy đủ các yêu cầu thử nghiệm và yêu cầu sản xuất của bạn.
Giới thiệu về Guidling
Guidling Technology là một doanh nghiệp công nghệ cao quốc gia tập trung vào dược phẩm sinh học, nuôi cấy tế bào, tinh chế và cô đặc y sinh học, chẩn đoán và chất lỏng công nghiệp. Chúng tôi đã phát triển thành công các thiết bị lọc ly tâm, băng siêu lọc & vi lọc, bộ lọc vi rút, hệ thống TFF, bộ lọc sâu, sợi rỗng, v.v. đáp ứng đầy đủ các tình huống ứng dụng của dược phẩm sinh học, nuôi cấy tế bào, v.v. Màng và bộ lọc màng của chúng tôi được sử dụng rộng rãi trong quá trình cô đặc, chiết xuất và tách tiền lọc, vi lọc, siêu lọc và lọc nano. Nhiều dòng sản phẩm của chúng tôi, từ lọc phòng thí nghiệm nhỏ, sử dụng một lần đến hệ thống lọc sản xuất, thử nghiệm vô trùng, lên men, nuôi cấy tế bào, v.v., đáp ứng nhu cầu thử nghiệm và sản xuất. Guidling Technology mong muốn được hợp tác với bạn!
