Nguyên tắc cơ bản và quy trình tổng hợp peptide pha rắn (SPPS)

Tổng hợp peptide pha rắn (SPPS)là phương pháp tổng hợp peptit trên chất mang rắn. Các chiến lược SPPS chính bao gồmPhương pháp BocvàPhương pháp Fmoc. Tổng hợp peptide là một quá trình lặp đi lặp lại của việc bổ sung tuần tự các axit amin và thường được thực hiện từĐầu C{0}}(đầu carboxyl)đếnĐầu cuối N{0}} (đầu amino). Đầu tiên, nhóm carboxyl của axit amin đầu tiên của peptide mục tiêu được liên kết cộng hóa trị với chất mang rắn (nhựa). Sử dụng nhóm amino của axit amin này làm điểm bắt đầu, nhóm bảo vệ đầu cuối N{2}} bị loại bỏ và chuỗi peptide đang phát triển được kéo dài ra do phản ứng với lượng dư axit amin thứ hai được kích hoạt. Chu kỳ này-khớp nối → giặt → khử bảo vệ → trung hòa và rửa → khớp nối tiếp theo-được lặp lại cho đến khi đạt được độ dài peptit mong muốn. Cuối cùng, chuỗi peptide được tách ra khỏi nhựa và được tinh chế để thu được peptide mục tiêu. Khi nhóm -amino được bảo vệ bằngBoc (tert-butyloxycarbonyl), phương pháp này được gọi làTổng hợp peptit pha rắn-dựa trên Boc-. Khi nhóm -amino được bảo vệ bằngFmoc (9-fluorenylmethyloxycarbonyl), nó được gọi làQuá trình tổng hợp peptide pha rắn{1}}dựa trên Fmoc.

 

Tổng hợp peptit pha rắn-dựa trên Boc-(Phương pháp Boc)

trongPhương pháp Boc, Nhóm Boc có thể loại bỏ bằng axit trifluoroacetic (TFA)được sử dụng để bảo vệ -nhóm amino, đồng thờinhóm bảo vệ loại benzyl-được sử dụng cho chuỗi bên. Trong quá trình tổng hợp, axit amin -được bảo vệ bởi Boc-đầu tiên được liên kết cộng hóa trị với nhựa. Nhóm Boc sau đó được loại bỏ bằng TFA và đầu amino tự do thu được sẽ được trung hòa bằng triethylamine. Axit amin tiếp theo được kích hoạt bằng cách sử dụngDCC (dicyclohexylcarbodiimide)và kết hợp để kéo dài chuỗi peptide. Sau khi hoàn thành quá trình lắp ráp, peptit mục tiêu được tách ra khỏi nhựa bằng axit mạnh, thông thườnghydro florua khan (HF)hoặcaxit trifluoromethanesulfonic (TFMSA).Trong phương pháp tổng hợp Boc, cần phải xử lý axit lặp đi lặp lại để loại bỏ các nhóm bảo vệ trước mỗi bước ghép. Điều này có thể dẫn đến một số phản ứng phụ, chẳng hạn như sự phân cắt sớm peptide từ nhựa và sự mất ổn định của chuỗi bên axit amin trong điều kiện axit, dẫn đến các phản ứng phụ không mong muốn.

 

Tổng hợp peptide pha rắn-dựa trên Fmoc (Phương pháp Fmoc)

TRONG1978, Meienhofer và Athertonđã phát triển chiến lược tổng hợp peptide bằng cách sử dụngFmoc (9-fluorenylmethyloxycarbonyl)là -nhóm bảo vệ amino, được gọi làPhương pháp Fmoc. Theo cách tiếp cận này, nhóm -amino được bảo vệ bằngcơ sở-Fmoc không bền vững, trong khi chuỗi bên được bảo vệ bằngnhóm bảo vệ loại axit-không bền Boc-.Ưu điểm chính của Fmoc với tư cách là nhóm bảo vệ-amino làsự ổn định trong điều kiện axit; nó không bị ảnh hưởng bởi việc xử lý bằng thuốc thử nhưaxit trifloaxetic (TFA)và có thể được loại bỏ có chọn lọc bằng cách sử dụngcơ sở nhẹ. Đồng thời, các nhóm bảo vệ chuỗi bên-như Boc ổn định trong điều kiện cơ bản và bị loại bỏ khi xử lý bằng axit. Cuối cùng, peptit được tách ra khỏi nhựa bằng cách sử dụngTFA/diclorometan (DCM), tránh sử dụng axit mạnh và từ đó cải thiện tính an toàn và khả năng tương thích với quá trình tổng hợp peptide thông thường.

 

Lịch sử phát triển của quá trình tổng hợp peptit pha rắn-(SPPS)

1.Giai đoạn nền tảng (Đầu thế kỷ 20 đến 1963)

TRONG1902, Emil Fischerlà người đầu tiên khám phá quá trình tổng hợp peptit, nhưng tiến độ còn chậm do hạn chế về mặt kỹ thuật. Tổng hợp sớm được sử dụngNhóm bảo vệ benzoyl và acetyl, khó loại bỏ và thường dẫn đếnsự phân tách chuỗi peptit.

TRONG1932, Max Bergmannvà đồng nghiệp-đã giới thiệunhóm benzyloxycarbonyl (Z)với tư cách là -nhóm bảo vệ amino. Nhóm này có thể bị xóa theohydro hóa xúc tác hoặc điều kiện axit, cung cấp một công cụ đáng tin cậy hơn để tổng hợp peptit và đặt nền móng cho sự phát triển quá trình tổng hợp peptit pha rắn vào những năm 1960.

Trong thời gian1950s, các nhà khoa học đã tổng hợp thành công nhiều loạipeptide hoạt tính sinh học, chẳng hạn nhưoxytocin và insulin. Những thành tựu này đã nâng cao hơn nữa hoạt động hóa học peptit và tạo nền tảng cho sự xuất hiện của quá trình tổng hợp peptit pha rắn.

 

2. Giai đoạn tiên phong (1963)

TRONG1963, Robert B. Merrifieldđề xuấtphương pháp tổng hợp peptit pha rắn (SPPS), trong đóAxit amin đầu C{0}}được neo vào giá đỡ nhựa và chuỗi peptide được kéo dài qua các chu kỳ lặp đi lặp lạidebảo ​​vệ và khớp nối. Cách tiếp cận này đã đơn giản hóa rất nhiều quá trình tổng hợp peptit và trở thành phương phápphương pháp ưa thíchđể lắp ráp peptit.

Merrifield đã qua sử dụngBoc (tert-butyloxycarbonyl)để bảo vệ -nhóm amino. Vào cuối những năm 1960, ông cũng đã phát triểnmáy tổng hợp peptide hoàn toàn tự động đầu tiênvà tổng hợp thành côngprotein sinh họcchẳng hạn nhưribonuclease (124 axit amin). Với những thành tựu mang tính đột phá này, Merrifield đã được trao giải thưởngGiải Nobel Hóa học năm 1984.

 

3. Giai đoạn đổi mới công nghệ (1972)

TRONG1972, Lou cá chépđã phát triểnNhóm bảo vệ 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc), có thể làloại bỏ nhẹ nhàng trong điều kiện cơ bản, giảm phản ứng phụ. Điều này làm cho nó đặc biệt thích hợp chopeptide phức tạpVàtổng hợp tự động.

cácPhương pháp Fmocdần dần thay thế phương pháp Boc làm chiến lược chủ đạo. Máy tổng hợp peptide tự động dựa trên cả haiHóa học Fmoc và Bocsau đó đã được phát triển, thúc đẩytự động hóa tổng hợp peptidevà cải thiện đáng kể hiệu quả và khả năng tái sản xuất.

 

4. Giai đoạn trưởng thành và mở rộng (Thập niên 1990 đến nay)

Tối ưu hóa nhựa và thuốc thử:Phát triển củanhựa biến tính PEG-có tải trọng cao, ưa nướcvà các thuốc thử ghép hiệu quả nhưHBTUVàHÀ TÚđã cải thiện đáng kể hiệu quả và năng suất của quá trình tổng hợp peptide pha rắn (SPPS).

Tích hợp công nghệ:Những cách tiếp cận mới nhưtổng hợp có sự hỗ trợ của lò vi sóng-Vàdòng chảy hóa họcđã rút ngắn thời gian phản ứng và tăng hiệu suất hơn nữa.

 

Nguyên tắc cơ bản và quy trình làm việc của SPPS:
Nguyên tắc cốt lõi của quá trình tổng hợp peptit pha rắn-làxây dựng chuỗi peptide theo từng bước trên một giá đỡ vững chắc, sử dụngchiến lược bảo vệ nhómVàphản ứng ngưng tụ (khớp nối)để đạt đượclắp ráp peptide hiệu quả và có thể kiểm soát.

1.Vai trò của chất mang rắn (Nhựa) trong quá trình tổng hợp peptit pha rắn (SPPS)

A nhựa polyme không hòa tan-chẳng hạn nhưnhựa liên kết chéo polystyrene-divinylbenzen-, nhựa Wang hoặc nhựa Rink amit-được chọn làm điểm hỗ trợ vững chắc trong SPPS. Bề mặt nhựa chứanhóm chức năng(ví dụ, nhóm hydroxyl hoặc amino) có thể hình thànhliên kết cộng hóa trị với một đầu của chuỗi peptit, thường làĐiểm cuối C{0}}, neo peptit vào giá đỡ vững chắc. Sự gắn kết cộng hóa trị này đảm bảo rằng peptit đang phát triểnvẫn liên kết với nhựa trong suốt quá trình tổng hợp, điều đó rất lớntạo điều kiện thuận lợi cho các bước phản ứng tiếp theo, rửa và tinh chế

 

2.Chiến lược nhóm bảo vệ trong quá trình tổng hợp peptide pha rắn{1}}(SPPS)

Trong quá trình tổng hợp peptide,-nhóm amino, nhóm cacboxyl và nhóm chức chuỗi bên phản ứng{1}}Các axit amin (như nhóm thiol, cacboxyl và amino) dễ bịphản ứng phụ. Để ngăn chặn những phản ứng không mong muốn này,nhóm bảo vệđược sử dụng. Các nhóm bảo vệ phổ biến bao gồm:-Nhóm bảo vệ amino:

Boc (tert-butyloxycarbonyl):Axit-không bền, dễ dàng loại bỏ dướiđiều kiện axit.

Fmoc (9-fluorenylmethyloxycarbonyl):Ổn định trong điều kiện axit, có thể được loại bỏ dướiđiều kiện cơ bản(ví dụ: dung dịch piperidine/DMF).Nhóm bảo vệ chuỗi-bên:Được lựa chọn theo tính chất hóa học của chuỗi bên axit amin. Các nhóm thông thường bao gồmbenzyl (Bn), tert-butyl (tBu), trityl (Trt), v.v. Những nhóm này làbị loại bỏ khi kết thúc quá trình tổng hợp, thường là trong quá trình phân tách peptide từ nhựa, sử dụngaxit hoặc các điều kiện cụ thể khác.

 

3.C-Tích hợp đầu cuối đến đầu cuối N-trong SPPS

TRONGtổng hợp peptide pha rắn (SPPS), quá trình lắp ráp peptit thường bắt đầu ởĐầu C{0}}(đầu carboxyl)và tiến từng bước tớiĐầu cuối N{0}} (đầu amino). Điều này là doAxit amin đầu C-đầu tiên được gắn vào giá đỡ vững chắcvà các axit amin tiếp theo được liên kết vớiNhóm amino tự do của chuỗi peptide đã liên kết với nhựa, dần dần kéo dài chuỗi peptide.

 

4.Phản ứng ghép đôi trong quá trình tổng hợp peptit pha rắn-(SPPS)

Cần phải bảo vệ các axit aminkích hoạtđể họnhóm cacboxyl trở nên phản ứng, cho phép chúng tạo thành mộtliên kết peptitvới nhóm amino của peptit-liên kết với nhựa. Chungthuốc thử kích hoạtbao gồmcacbodiimit(ví dụ: DCC, DIC),HOBt, HÀ TÚ, VàPyBOP. Sau khi được kích hoạt, nhóm cacboxyl sẽ phản ứng với nhóm amino tự do theo kiểuphản ứng ngưng tụ, tạo thành mộtliên kết amitvà từ đó gắn axit amin mới vào chuỗi peptide đang phát triển.

 

5.Các hoạt động lặp lại (chu kỳ) trong quá trình tổng hợp peptit pha rắn-(SPPS)

Quá trình này bao gồmlặp lại chu trình khử bảo vệ → ghép nối → rửa, thêmmột axit amin mỗi chu kỳđể kéo dài dần chuỗi peptide. Sau mỗi lầnphản ứng ghép đôi, nhựa làrửa sạch(ví dụ: bằng các dung môi như DMF hoặc DCM) để loại bỏ các thuốc thử không phản ứng,-sản phẩm phụ và axit amin dư thừa. các-Nhóm amino của phần dư mới được thêm vào sau đó sẽ bị hủy bảo vệ, cho ra một amin tự do để chuẩn bị cho phản ứng ghép đôi tiếp theo. Chu trình này được lặp lại cho đến khi chuỗi peptide mong muốn được lắp ráp hoàn chỉnh.

 

6.Sự phân cắt trong quá trình tổng hợp peptit pha rắn-(SPPS)

Khi chuỗi peptide đã đạt đến độ dài mong muốn, nó sẽ đượcbị cắt khỏi sự hỗ trợ vững chắcsử dụng thuốc thử thích hợp, đồng thờiloại bỏ tất cả các nhóm bảo vệ. Thuốc thử phân tách thường được sử dụng làaxit trifloaxetic (TFA), mà không chỉphá vỡ liên kết giữa peptit và nhựanhưng cũng cóloại bỏ các nhóm bảo vệchẳng hạn như Fmoc và Boc, khôi phục peptit về trạng thái ban đầu của nóquê hương. Khi chuỗi peptide đã đạt đến độ dài mong muốn, nó sẽ đượcbị cắt khỏi sự hỗ trợ vững chắcsử dụng thuốc thử thích hợp, đồng thờiloại bỏ tất cả các nhóm bảo vệ. Thuốc thử phân tách thường được sử dụng làaxit trifloaxetic (TFA), mà không chỉphá vỡ liên kết giữa peptit và nhựanhưng cũng cóloại bỏ các nhóm bảo vệchẳng hạn như Fmoc và Boc, khôi phục peptit về trạng thái ban đầu của nóquê hương.

Thông qua các bước này,tổng hợp peptide pha rắn (SPPS)cho phéplắp ráp hiệu quả và có kiểm soát các chuỗi peptide trên một giá đỡ vững chắc, tránh được các bước tinh chế trung gian phức tạp cần có trong quá trình tổng hợp pha-dung dịch truyền thống và đáng kểnâng cao hiệu quả tổng hợp và năng suất.

Thông qua các bước này,tổng hợp peptide pha rắn (SPPS)cho phéplắp ráp hiệu quả và có kiểm soát các chuỗi peptide trên một giá đỡ vững chắc, tránh được các bước tinh chế trung gian phức tạp cần có trong quá trình tổng hợp pha-dung dịch truyền thống và đáng kểnâng cao hiệu quả tổng hợp và năng suất.