Công nghệ màng và làm rõ vắc-xin (Ⅱ)

Trong bài viết trước, chúng tôi đã có một số giới thiệu sơ bộ về vắc-xin và các chiến lược làm rõ vắc-xin, và chúng tôi sẽ tiếp tục khám phá chúng trong phần còn lại của bài viết này. Tiếp theo từ trên, chúng tôi sẽ tiếp tục chia sẻ các giải thích vắc-xin và các ứng dụng mô màng liên quan.

 

2.2.2 Ảnh hưởng của tính chất vật lý và hóa học của virus

Sau khi xem xét hệ thống sản xuất và các phương pháp loại bỏ các chất gây ô nhiễm có liên quan trong bước làm trong, điều quan trọng là phải tính đến đặc điểm của vi-rút và tập trung vào việc tối đa hóa sản lượng vi-rút.

 

2.2.2.1 Dễ dàng hấp thụ virus
Các vật liệu tích điện dương và chất hỗ trợ lọc (như diatomit) đã được phát triển để cải thiện hiệu ứng lọc sâu. Mặc dù điện tích dương làm tăng khả năng bắt giữ axit nucleic và HCP, diatomit được biết là có khả năng liên kết các mảnh vỡ tế bào và keo. Tuy nhiên, các vật liệu này cũng có thể giữ lại vi-rút thông qua cơ chế hấp phụ. Vì vi-rút thường tích điện âm trong dung dịch nên có thể xảy ra tương tác tĩnh điện với bộ lọc tích điện dương.
Virus cũng có thể liên kết bằng các tương tác kỵ nước hoặc không đặc hiệu với một số vật liệu lọc nhất định (như diatomit hoặc sợi thủy tinh). Virus có vỏ bọc, do có vỏ bọc lipid, dễ bị hấp phụ này hơn. Nếu virus được hấp phụ vào bộ lọc thông qua các tương tác tĩnh điện và các hạt virus bị tách ra do cạnh tranh muối, rửa bộ lọc bằng dung dịch đệm dẫn điện cao có thể phục hồi một phần virus. Tuy nhiên, điều này cũng có thể rửa trôi các chất gây ô nhiễm như HCP hoặc axit nucleic. Do đó, việc sử dụng vật liệu lọc thay thế, chẳng hạn như polypropylen trơ hơn, được ưu tiên.
Adenovirus is easily adsorbed, but different results have been confirmed. Using positively charged diatomite and deep filters. Borosilicate glass fiber filter material is also very well recovered. On the other hand, a patent proposed by Weggeman involving clarification of 20 – 40% adenovirus losses at PER, et al. Cell cultures were prepared with similarly positively charged deep filters containing diatomite. In this case, the nominal polypropylene filter showed a very high viral recovery rate (> 90%).
Người ta đều biết rằng vi-rút cúm dễ bị mất do hấp phụ trong quá trình làm trong. Do đó, việc sử dụng bộ lọc không tích điện, bộ lọc gốc polypropylene, phù hợp để làm trong bộ sưu tập cúm. Thompson và cộng sự đã báo cáo việc sử dụng bộ lọc polypropylene định mức danh nghĩa 1,2 μm tiếp theo là màng PVDF 0.45 μm để làm trong vi-rút cúm có nguồn gốc tế bào do tế bào MDCK tạo ra. Tổng cộng có chín thử nghiệm tinh chế được thực hiện ở thang 20L, tải 111 L / m2 cho bộ lọc polypropylene 1,2 μm và 105 L / m2 cho bộ lọc PVDF 0,45 μm. Kết quả cho thấy phần lớn các vi-rút đang chạy đều phục hồi tốt (78-154%). Họ cũng báo cáo loại bỏ tới 58% hcDNA, nhưng không loại bỏ HCP đáng kể.

 

2.2.2.2 Cắt bỏ các loại virus nhạy cảm

Một số loại virus (có hoặc không có vỏ bọc) có sức đề kháng cơ học thấp và có thể bị phá hủy do tiếp xúc với lực cắt trong các bước ly tâm và lọc màng. Lực cắt sinh ra trong các bước tinh chế liên quan đến lọc hoặc sắc ký có thể khiến lớp vỏ virus rơi ra, do đó ảnh hưởng đến khả năng lây nhiễm. Tùy thuộc vào kích thước, độ dày và hình dạng của vỏ capsid, vỏ capsid của virus có thể giòn hoặc ngược lại, có khả năng phục hồi trước áp suất cao. Một số loại virus có vỏ bọc, chẳng hạn như virus cúm, có tính đàn hồi trước ứng suất cơ học và có thể chịu được biến dạng lớn. Mặt khác, lực cắt có thể khiến lớp vỏ của các loại virus có sức đề kháng kém hơn, chẳng hạn như retrovirus, rơi ra, do đó ảnh hưởng đến khả năng lây nhiễm của virus.

VLP vỏ ngoài tạo ra từ ngoại bào cũng rất dễ bị tổn thương. Tốc độ cắt cao được tạo ra trong quá trình ly tâm, chủ yếu ở các bộ phận đầu vào và đầu ra (tốc độ cắt cao được tạo ra ở giao diện khí-lỏng). Khi vi-rút được tinh chế bằng phương pháp ly tâm gradient, khả năng chuyển gen của một số retrovirus bị suy yếu đáng kể. Khi thiết kế quá trình tách ly tâm, phải xem xét đến sự bất ổn tương đối của các hạt vi-rút đối với lực cắt. Lực ly tâm không phải là nguồn duy nhất gây ra sốc cắt, quan trọng hơn là thiết kế thiết bị, đặc biệt là ở khâu nhập khẩu và xuất khẩu cũng có sốc cắt đáng kể. Sự khác biệt trong thiết kế các thang đo khác nhau có thể dẫn đến sự khác biệt về năng suất và khả năng phục hồi của vi-rút nhạy cảm với lực cắt ở các thang đo khác nhau.

Virus nhạy cảm với lực cắt nên được thiết kế cẩn thận vì cường độ ứng suất cắt và thời gian tiếp xúc với ứng suất (do tuần hoàn) có thể cao. Đối với virus nhạy cảm với lực cắt, các thiết bị mạch hở (sợi rỗng hoặc thiết bị tấm hở) được ưu tiên để giảm nhiễu loạn và lực cắt trong kênh cấp liệu.

Việc lựa chọn các thông số vận hành cũng phải giảm thiểu tối đa thiệt hại cho các hạt vi-rút: lưu lượng chéo thấp, áp suất xuyên màng (TMP) trung bình và thời gian xử lý ngắn.

Nhiễm bẩn màng dưới áp suất cao dẫn đến mất khả năng lây nhiễm của vi-rút, có thể là do các lực mà tác động cắt có thể tác động lên lớp vỏ vi-rút. Tách dựa trên màng dựa trên kích thước và sự tích tụ của các chất ức chế vi-rút có trọng lượng phân tử lớn và các hạt vi-rút có thể làm giảm khả năng lây nhiễm của các vectơ vi-rút.

Sự phân hủy của các loại virus nhạy cảm với lực cắt trong quá trình lọc sâu không được ghi chép rộng rãi. Việc mất virus trong quá trình lọc sâu thường được quy cho sự bẫy, hấp phụ hoặc sự phân hủy virus phụ thuộc vào thời gian và nhiệt độ của sản phẩm. Trên thực tế, mặc dù ứng suất cơ học có thể xảy ra trong các hệ thống NFF, thời gian tiếp xúc của các sản phẩm NFF với lực cắt rất ngắn so với các công nghệ khác do quá trình truyền qua nhanh một lần trong các sản phẩm NFF.

 

2.2.2.3 Chặn theo kích thước khẩu độ

Có thể giữ lại vi-rút có kích thước trên 100 nm bằng cách loại bỏ mycoplasma hoặc màng vô trùng (0.22 μm trở xuống). Trong trường hợp này, cần đặc biệt chú ý đến việc lựa chọn bộ lọc. Đối với các bước TFF vi lọc, màng 0.45μm hoặc 0,65μm được ưu tiên cho các kênh sản phẩm tốt. Đối với quá trình lọc nhiều bước NFF, lớp dày đặc nhất phải Lớn hơn hoặc bằng 0,45μm. Cần cẩn thận khi chọn bộ lọc sâu, vì một số thiết bị lọc sâu có thể chứa một lớp màng, có thể dẫn đến mất sản phẩm do quá trình giữ lại. Sự kết tụ của vi-rút ảnh hưởng tiêu cực đến quá trình sản xuất vi-rút và tăng cường khả năng giữ lại vi-rút do kích thước vi-rút.

Theo bằng sáng chế của Andre và Champluvier, quá trình đồng nhất hóa có thể ngăn ngừa hoặc hạn chế tắc nghẽn bộ lọc bằng cách giảm kích thước của cốt liệu, mang lại năng suất cao hơn. Quá trình đồng nhất hóa cũng cải thiện khả năng lọc của vụ thu hoạch, tăng lên 2.4-3 lần.

Quá nhiều tạp chất có thể cản trở quá trình phục hồi vi-rút. Các tạp chất có xu hướng làm tắc bộ lọc và các lỗ màng bị tắc có thể dẫn đến giảm tỷ lệ vi-rút đi qua. Trong một bằng sáng chế của de Vocht và Veenstra, có đề cập rằng việc làm trong trực tiếp mật độ tế bào cao Per. Thu thập bằng màng TFF ({{0}.65 hoặc 0.2 μm) dẫn đến phục hồi vi-rút không có adenovirus. Có thể phục hồi bằng cách loại bỏ kết tủa chọn lọc DNA của tế bào chủ trước bước TFF 0,65 μm. 70% adenovirus.

 

 

2.3 Nghiên cứu tình huống: Tối ưu hóa quá trình làm rõ vắc-xin virus

Tại Hội nghị quốc tế về các quy trình sinh học năm 2011, Sanofi Pasteur đã trình bày một cách tiếp cận hợp lý để sàng lọc các bộ lọc nhằm phát triển các trình tự làm trong mới cho các vắc-xin virus ứng viên. Nghiên cứu này nhằm mục đích khắc phục các vấn đề gặp phải trong quá trình tối ưu hóa các quy trình nuôi cấy tế bào và virus. Các sửa đổi đối với quy trình thượng nguồn dẫn đến mất 20% năng suất và ô nhiễm bộ lọc sớm trong bước làm trong, dẫn đến không mở rộng quy mô. Để thiết lập một bước làm trong mạnh mẽ và có thể mở rộng quy mô, cần phải phát triển lại hoàn toàn trình tự bộ lọc, với tỷ lệ phục hồi virus cao hơn 85%.

Based on internal experience and scientific publications, the team selected 27 filters for an initial screening study. Small scale virus adsorption tests were performed on various filter media (polypropylene, nylon, cellulose ester, glass fiber, charged adsorption filter) and structures (pleated or deep filter). The virus yield was measured by ELISA and the clarifying efficiency of the preselected filtrate was compared by checking the reduction of turbidity. Preliminary screening studies showed that nylon and charged filters retained viral particles and virus recovery. Ten percent. The virus recovery rate of polypropylene and polyether sulfone filter was >. 80%. Tỷ lệ thu hồi của bộ lọc este xenlulo và sợi thủy tinh phụ thuộc vào việc đánh giá bộ lọc (20% hoặc 90%).

Bước thứ hai, Sanofi Pasteur đã đánh giá một số kết hợp (chuỗi pha 2 hoặc pha 3) của bảy bộ lọc được chọn trước trong nghiên cứu sàng lọc. Thử nghiệm phân loại dòng chảy liên tục được thực hiện với một bộ lọc nhỏ. Ngoài ra, thí nghiệm này sử dụng năng suất cao hơn so với nghiên cứu sàng lọc. Dựa trên kết quả phục hồi vi-rút và khả năng lọc, nhóm đã chọn hai kết hợp tốt nhất để nghiên cứu thêm.

- Chuỗi 1 (Giai đoạn 2): Bộ lọc sơ bộ polypropylene gấp định mức danh nghĩa 30 μm, tiếp theo là bộ lọc nhiều lớp sợi thủy tinh và este xenlulo tổng hợp (độ xốp 1/0,5 μm)

- Chuỗi 2 (giai đoạn 3): cùng một bộ lọc sơ bộ (bộ lọc polypropylene định mức 30 μm), tiếp theo là bộ lọc polypropylene nhiều lớp trung gian và cuối cùng là màng polyether sulfone không đối xứng.

 

The robustness of these two clarified sequences has been challenged by repeated constant flow sizing experiments with different harvest batches. While both potential sequences demonstrated enhanced capabilities compared to the reference sequence, only sequence 1 achieved virus recovery objectives (>85%), như thể hiện trong Hình 1.

Hình 1 Phục hồi virus trung bình tại mỗi bước lọc. Các nghiên cứu về độ ổn định đã được đánh giá cho ba trình tự lọc, trong đó chỉ có trình tự 1 sử dụng polypropylene gấp định mức danh nghĩa 30 μm và bộ lọc este cellulose 1.0/0,5 μm và sợi thủy tinh đạt mục tiêu phục hồi toàn cầu.

Ly tâm cũng được đánh giá là bước làm trong chính, tiếp theo là quá trình lọc cuối cùng của {{0}}.45 μm. Một số cặp tốc độ/thời gian đã được thử nghiệm. Mặc dù tốc độ lọc 0,45 μm đã tăng gấp đôi, nhưng sản lượng cuối cùng vẫn thấp hơn mục tiêu là 85%. Do đó, ly tâm vẫn chưa được nghiên cứu thêm.

Cuối cùng, hiệu suất của chuỗi lọc polypropylene và sợi thủy tinh đã được đánh giá trên quy mô lớn hơn (kích thước lò phản ứng sinh học 160 L). Chuỗi lọc được hiển thị trong Hình 2.

Hình 2 Làm rõ tổ hợp bộ lọc và biểu diễn đồ họa về năng suất bước của chuỗi. Chuỗi A là quy trình truyền thống và chuỗi B là quy trình được tối ưu hóa. Chuỗi B được tối ưu hóa có thể giảm diện tích lọc trước 3 lần, hủy bước lọc trung gian và giảm diện tích lọc cuối cùng 10 lần, do đó tăng khả năng phục hồi virus toàn cầu lên 3%.

Một số lô đã được làm trong thành công mà không có dấu hiệu tắc nghẽn bộ lọc, thời gian xử lý phù hợp với giới hạn sản xuất và năng suất vi-rút > Tám mươi lăm phần trăm. Việc tối ưu hóa bước làm trong không ảnh hưởng đến các bước hạ lưu và các thuộc tính chất lượng chính của vắc-xin. Do đó, trình tự làm trong đã chọn đã được sử dụng trong quy trình sản xuất vắc-xin (lò phản ứng sinh học cỡ 1000 L) và hiệu suất đã được xác nhận thành công.

 

03 Làm rõ về vắc-xin vi khuẩn

3.1 Những cân nhắc để làm rõ vắc-xin vi khuẩn

Theo Medical Thesaurus (2015), vắc-xin vi khuẩn được định nghĩa là hỗn dịch vi khuẩn đã pha loãng hoặc đã chết hoặc các dẫn xuất kháng nguyên của chúng được sử dụng để tạo ra phản ứng miễn dịch nhằm ngăn ngừa hoặc điều trị các bệnh do vi khuẩn. Nói chung, vắc-xin vi khuẩn có thể được chia thành bốn loại phụ dựa trên loại kháng nguyên hoạt động. Tác nhân này có thể là:

- Giết chết hoặc làm suy yếu toàn bộ vi khuẩn sống. Còn được gọi là vắc-xin BCG.

- Tinh chế các yếu tố quyết định kháng nguyên (vắc xin tiểu đơn vị). Vắc xin bệnh than hoặc vắc xin ho gà vô bào.

- Độc tố vi khuẩn (độc tố). Độc tố bạch hầu, uốn ván.

- Plasmid (pDNA).

Do tính không đồng nhất rộng rãi của các sản phẩm của gia đình, các thách thức của quá trình thượng nguồn và hạ nguồn phần lớn phụ thuộc vào loại vắc-xin được sản xuất. Do đó, sau bước lên men ban đầu có thể được tinh chế hoặc không tinh chế, để có thể thực hiện bước làm trong.

 

3.2 Chiến lược làm rõ vắc-xin vi khuẩn

3.2.1 Độc tố

Hai loại độc tố phổ biến nhất được sản xuất để sử dụng vắc-xin là bạch hầu và uốn ván, được sản xuất bởi Corynebacterium diphtheriae và Clostridium tetani. Việc sản xuất cả hai loại vắc-xin đều phải tuân theo các yêu cầu quản lý nghiêm ngặt. Báo cáo kỹ thuật của WHO và các phụ lục của báo cáo đưa ra các khuyến nghị rõ ràng để đảm bảo chất lượng, tính an toàn và hiệu quả của vắc-xin uốn ván và bạch hầu. Thực hành sản xuất tốt chung được áp dụng cho việc sản xuất cả hai loại vắc-xin và nhân viên phải được đào tạo bài bản và được tiêm vắc-xin tăng cường chống lại cả hai bệnh.

GMP yêu cầu nghiêm ngặt rằng độ tinh khiết và chất lượng của sản phẩm cuối cùng phải được chứng minh. Theo WHO và EP, hiệu quả của vắc-xin uốn ván cuối cùng phải được xác định bằng cách so sánh in vivo hoặc với bất kỳ phương pháp đã được chứng minh nào khác với một chất tham chiếu thích hợp được hiệu chuẩn theo đơn vị quốc tế theo Tiêu chuẩn quốc tế về độc tố uốn ván. Các yêu cầu cập nhật về hiệu quả đã được công bố vào năm 2011 và có thể thay đổi tùy thuộc vào phương pháp đánh giá. Tính an toàn (không độc tố và độc tính phục hồi) của từng lô vắc-xin cũng phải được chứng minh. Cuối cùng, tính ổn định của vắc-xin, đặc biệt là theo thời gian thực, phải được giải quyết.

 

3.2.2 Vắc-xin DNA Plasmid

Vắc-xin DNA plasmid được sử dụng cho mục đích sức khỏe động vật và một số vắc-xin DNA plasmid dùng cho người đang trong các giai đoạn phát triển và đánh giá lâm sàng khác nhau. Sau quá trình lên men E. coli, vi khuẩn được thu thập và phân cắt để giải phóng DNA plasmid.

Việc loại bỏ các mảnh vụn tế bào thường được thực hiện bằng cách ly tâm hoặc lọc. Chủ đề này đã được đề cập rộng rãi trong các ấn phẩm gần đây. Trong ấn phẩm này, các quy trình và thách thức hiện tại của pDNA ở thượng nguồn, hạ nguồn và công thức.

Các tác giả cũng cung cấp thông tin chi tiết về những khoảng trống ở mỗi bước của quy trình sản xuất pDNA thông thường và những cải tiến tiềm năng trong tương lai và/hoặc những khoảng trống công nghệ hiện tại có thể dẫn đến tối ưu hóa quy trình hơn nữa.

Vắc-xin DNA plasmid được chuẩn bị theo hai bước. Đầu tiên, các tế bào vi khuẩn được loại bỏ khỏi môi trường nuôi cấy và thứ hai, các mảnh vụn tế bào sau khi tế bào bị phân hủy được loại bỏ. Tùy thuộc vào quy mô, các tế bào được thu thập bằng cách ly tâm hoặc vi lọc TFF. Máy ly tâm đĩa-cọc được đẩy ra không liên tục ở tốc độ cao và sản lượng plasmid siêu xoắn kém do hư hỏng do cắt trong quá trình xả. Nếu phải sử dụng ly tâm, máy ly tâm bát rắn là tốt nhất. Các thiết bị TFF phẳng, kênh mở với màng vi lọc 0.1 hoặc 0.2 μm hoặc các thiết bị sợi rỗng có thể hoạt động tốt.

Vì các thiết bị sợi rỗng có khả năng chịu tải rắn cao nên đôi khi chúng được ưu tiên. Thông thường, các quy trình này hoạt động ở 3-5 lần nồng độ, tiếp theo là 3-5 thể tích lọc qua màng. Để giảm lực cắt và kiểm soát tốt hơn sự phân cực màng, các hoạt động kiểm soát thâm nhập được khuyến khích mạnh mẽ. Mặc dù máy ly tâm tiết kiệm chi phí hơn trong các hoạt động thương mại quy mô lớn, các quy trình quy mô nhỏ hơn có xu hướng sử dụng lọc vì tính di động và dễ vận hành.

Chất kết bông đã được sử dụng để tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình xử lý, nhưng nó có thể dẫn đến mất sản phẩm. Một số người cũng khuyến nghị sử dụng các hạt đất diatomit trơ, sau đó là lọc túi.

Cell lysis produces viscous products, including large particles, cell fragments, soluble impurities, fine colloidal particles, and pDNA. Due to the complexity of the material, removing such fine solids is a difficult separation. Gradient density deep filter or open hole structure (>Bộ lọc màng 0.45m) có tác dụng loại bỏ các mảnh vụn tế bào. Do các mảnh vụn tế bào bị tắc nghẽn mạnh, nên ưu tiên lọc lưu lượng thấp hoặc áp suất thấp. Các bộ lọc vi mô dựa trên Tff đã được sử dụng cho bước này và các bộ lọc túi quy mô công nghiệp. Quá trình nứt tĩnh (trong bình trộn) và liên tục (sử dụng máy trộn tĩnh trong dòng) đòi hỏi các bộ lọc khác nhau.

 

3.3 Nghiên cứu trường hợp: So sánh hiệu quả của phương pháp ly tâm, NFF và TFF trong việc làm trong độc tố uốn ván

Muniandi và cộng sự đã so sánh ba phương pháp khác nhau để làm trong độc tố uốn ván và độc tố từ dịch lên men, cụ thể là ly tâm, lọc sâu (NFF) và TFF. Vật liệu thử nghiệm được sản xuất trong máy lên men 400L sử dụng môi trường Miller đã được sửa đổi (MMM). Trong nghiên cứu ly tâm, các tế bào được tách ra khỏi tim ở tốc độ 4000 vòng/phút trong một thùng chứa 6 × 1L trong 60 phút. Các mẫu dịch nổi được lấy để phát hiện sự phục hồi độc tố. Lọc sâu sử dụng các bộ lọc sâu 0,45μm và 0,22μm chứa đất diatomit và xenluloza để làm trong dịch lên men. Quá trình này được thực hiện ở nhiệt độ 35 độ và 12psi.

Một mô-đun TFF dạng tấm phẳng mở được liên kết nhiệt với màng PVDF 0.22μm theo phương pháp TFF. Quá trình làm trong dựa trên TFF được thực hiện ở tốc độ dòng chảy chéo là 2000 L/h ở 23 độ và dịch lọc đã làm trong được cô đặc ở tốc độ dòng chảy chéo là 1000 L/h ở 25 độ bằng cách sử dụng màng PES 30kD sandwich TFF thông thường. Chất lỏng thịt đã làm trong (khoảng 6L) được cô đặc 10 lần trong quá trình siêu lọc này. Các thử nghiệm độc tố uốn ván đã được thực hiện trên các mẫu chất giữ lại cô đặc để đánh giá khả năng thu hồi sản phẩm.

Lọc sâu dẫn đến tỷ lệ thu hồi sản phẩm khoảng 89%, với các đơn vị TFF dẫn đến tỷ lệ thu hồi sản phẩm trên 97%. Các quy trình vi lọc và siêu lọc luôn mang lại tỷ lệ thu hồi sản phẩm cao hơn quy trình NFF. Những kết quả này dựa trên các thử nghiệm keo tụ (Lf).

 

04Làm rõ về vắc-xin polysaccharide

4.1 Xem xét làm rõ vắc-xin polysaccharide

Quy trình sản xuất vắc-xin polysaccharide không liên kết/tự do và vắc-xin polysaccharide liên kết đều bắt đầu bằng việc nuôi cấy vi khuẩn chủ trong bình lên men. Khi kết thúc quá trình lên men, vi khuẩn có thể được xử lý bằng các chất tẩy rửa như DOC (natri deoxycholate), Triton®X-100 hoặc các thuốc thử phù hợp khác để tiêu diệt vi khuẩn và thúc đẩy giải phóng polysaccharide. Do dung lượng pin lớn nên việc thu thập trực tiếp qua NFF không khả thi về mặt kinh tế vì thông lượng có thể rất thấp. Do đó, lựa chọn lý tưởng là sử dụng máy ly tâm để tách các cụm tế bào. Cũng có thể sử dụng phạm vi vi lọc TFF. Tâm/chất thấm không có tế bào chứa polysaccharide quan tâm được làm trong hơn nữa bằng hệ thống lọc sâu NFF, sau đó là lọc bằng phương pháp sinh học, rồi tiến hành xử lý hạ lưu để tinh chế thêm.

 

4.2 Chiến lược làm rõ vắc-xin polysaccharide

4.2.1 Thủ tục làm rõ đầu tiên

Ly tâm là một trong những kỹ thuật phổ biến nhất để tách tế bào khỏi chất lỏng lên men. Tùy thuộc vào quy mô, có thể lựa chọn ly tâm liên tục hoặc ly tâm mẻ. Điều quan trọng cần lưu ý là việc tối ưu hóa thích hợp các điều kiện ly tâm và hoạt động của chúng là điều cần thiết để tinh chế thành công ở hạ lưu. Khi lựa chọn màng TFF và kích thước lỗ cụ thể, điều quan trọng là phải ghi nhớ trọng lượng phân tử của polysaccharides, thường lớn và phức tạp về mặt cấu trúc, với trọng lượng phân tử dao động từ khoảng 500kDa đến hơn 1000kDa. Do kích thước lỗ hở lớn, việc sử dụng màng MF 0,22μm, 0,45μm, 0,65μm có thể đảm bảo thu hồi thành công các phân tử PS trong dung dịch thẩm thấu.

 

4.2.2 Quy trình làm trong thứ cấp

Độ trong/độ đục của dung dịch lên men không có tế bào đạt đến bước làm trong thứ cấp phụ thuộc vào vi khuẩn cụ thể, loại cắt, loại huyết thanh riêng lẻ và kỹ thuật được sử dụng cho bước làm trong chính. Độ đục của phần trung tâm có thể dao động từ khoảng 50 đến 150 NTU. Một bộ lọc sâu mật độ phân đoạn tích điện dương làm bằng diatomit tẩm với sợi xenluloza có thể được sử dụng để làm trong và giảm độ đục của nó xuống < 5NTU.

Lưu lượng thể tích của bộ lọc sâu này có thể dao động từ khoảng 150 L/m3 đến 250 L/m3. Thông thường, dung dịch sản phẩm đã được làm trong được lọc qua màng khử sinh học 0,45 μm hoặc màng khử trùng 0,22 μm tiếp theo để loại bỏ bất kỳ hạt tế bào, keo và vi sinh vật tiềm ẩn nào còn sót lại.

 

4.3 Nghiên cứu trường hợp: Làm rõ trung tâm của dịch lên men Streptococcus pneumoniae sau khi ly tâm

Các tế bào được tách ra bằng cách thêm {{0}.1% (v/v) dịch lên men Streptococcus pneumoniae loại 8 (20 L) bằng cách ly tâm liên tục. Phần giữa của bộ sưu tập được lọc qua hai bộ lọc sâu đất diatomit tích điện dương riêng biệt có chứa sợi xenlulo. Sau đó, dịch lọc sâu riêng lẻ được lọc qua màng PVDF 0,45μm cấp độ khử sinh học. Tất cả các thử nghiệm lọc đều được thực hiện ở chế độ dòng chảy không đổi với bơm nhu động. Các thử nghiệm lọc sử dụng bộ lọc sâu tích điện và dịch lên men Streptococcus pneumoniae huyết thanh loại 8 dẫn đến độ đục giảm từ khoảng 120 NTU xuống 3 NTU. Các thử nghiệm được thực hiện ở lưu lượng dòng chảy là 140.150 L/m2 /giờ và chênh lệch áp suất điểm cuối là 20-25 psi, với lưu lượng thể tích khoảng 180-200 L/m2.

Các thử nghiệm lọc tương tự đã được thực hiện trên dịch lên men của Streptococcus pneumoniae huyết thanh nhóm 19A. Chất lỏng 19A ly tâm được làm trong qua một bộ lọc sâu tích điện, làm giảm độ đục từ khoảng 40 NTU xuống còn 3 NTU. Các thử nghiệm đã được thực hiện ở tốc độ dòng chảy không đổi khoảng 140-160 L/m2 /giờ và lưu lượng thể tích là 200-230L/m2 đạt được ở áp suất điểm cuối khoảng 15 psid. Phân tích HLPC của các mẫu sản phẩm thu thập được trong quá trình thử nghiệm đánh giá lọc cho thấy không có tổn thất năng suất đáng kể nào đối với màng lọc sâu hoặc 0.45 μm (hoặc 0,22 μm).

 

05 Phần kết luận

Quá trình phát triển các quy trình làm trong đòi hỏi sự tích hợp của một số quy trình đơn vị như ly tâm, TFF-MF, lọc sâu và lọc vô trùng. Việc tối ưu hóa quy trình làm trong đòi hỏi phải hiểu cách các hoạt động đơn vị khác nhau ảnh hưởng đến nhau. Thách thức là lựa chọn các công nghệ và công cụ (thiết bị và đồ gá) để đáp ứng các yêu cầu ngày càng phức tạp của chất lỏng quy trình được tạo ra bởi các lò phản ứng sinh học hiệu quả hơn hiện nay. Sự gia tăng năng suất thượng nguồn (độ chuẩn virus, mật độ tế bào, v.v.), mảnh vụn tế bào và sản phẩm ly giải tế bào làm tăng độ khó của quy trình làm trong và gây nhầm lẫn trong việc lựa chọn thiết bị tách và lọc.

Thiết kế thiết bị, tính dễ sử dụng và độ sạch sẽ cần được cân nhắc khi lựa chọn quy mô quy trình. Điều này sẽ đảm bảo chuyển đổi hiệu quả và an toàn cho người vận hành khi xử lý các bộ lọc bị loại bỏ. Để phát triển quy trình làm trong, việc tích hợp chặt chẽ các bước làm trong là rất quan trọng để đảm bảo rằng quá trình xử lý thu hoạch ở thượng nguồn có hiệu quả về mặt chi phí. Một loạt các đơn vị lọc có sẵn để tạo điều kiện cho việc thử nghiệm trong phòng thí nghiệm, sản xuất thử nghiệm và xử lý quy mô đầy đủ. Bằng cách triển khai một kế hoạch công việc mở rộng quy mô được thiết kế tốt để đánh giá nhiều tùy chọn làm trong, người ta có thể tự tin lựa chọn và định cỡ các bộ lọc làm trong để bảo vệ các hoạt động của đơn vị hạ nguồn trong khi giảm chi phí vận hành.

Làm trong vắc-xin đặt ra một số thách thức. Thông thường, quá trình lọc cần được điều chỉnh theo hệ thống sản xuất, tác nhân bất hoạt hoặc ly giải, và trình bày kháng nguyên, không nhất thiết là vắc-xin. Các quy trình vắc-xin truyền thống thường sử dụng phương pháp ly tâm để làm trong vắc-xin ban đầu. Vắc-xin hiện đại với nhiều nền tảng công nghệ và khối lượng xử lý nhỏ hơn khiến vắc-xin phù hợp hơn để làm trong bằng các công nghệ dựa trên màng. Các vắc-xin mới được phát triển sử dụng các dòng tế bào và hệ thống biểu hiện hiện đại và sử dụng các điều kiện nuôi cấy tế bào được xác định rõ hơn khiến nhiều quy trình vắc-xin thuận lợi hơn cho quá trình lọc.

 

Tuy nhiên, tính không đồng nhất trong thành phần kháng nguyên hoặc "kháng nguyên mục tiêu" của các sản phẩm vắc-xin làm tăng tính phức tạp của quá trình làm trong lọc. Các kháng nguyên khác nhau về kích thước, tính chất hóa học bề mặt và điện tích. Những đặc điểm này ảnh hưởng đến năng suất và khả năng phục hồi của kháng nguyên. Vắc-xin đặt ra những thách thức riêng biệt đối với quá trình làm trong, chủ yếu là do kích thước của các đại phân tử của chúng. Điều này, kết hợp với các vấn đề về năng lực xung quanh quá trình làm trong, làm tăng nhu cầu hướng dẫn về các chiến lược phát triển quy trình.

Quy mô và kích thước của hoạt động sản xuất vắc-xin quy mô thương mại có tác động đáng kể đến việc lựa chọn công nghệ làm trong. Nằm ở thượng nguồn của quy trình, việc tối ưu hóa làm trong thích hợp là rất quan trọng đối với sự thành công của các hoạt động đơn vị hạ nguồn, tối đa hóa năng suất, khả năng thu hồi và độ bền của quy trình. Trong khi ly tâm vẫn là một lựa chọn kỹ thuật khả thi cho quá trình làm trong sơ cấp, các đơn vị vi lọc kênh mở (TFF) để làm trong sơ cấp và các bộ lọc sâu mịn hoặc bộ lọc màng để làm trong thứ cấp đang được chấp nhận trong ngành công nghiệp vắc-xin. Sự thay đổi này được thúc đẩy bởi nhu cầu xử lý nhanh hơn, phát triển quy trình nhanh chóng, quy trình di động và triển khai sử dụng một lần. NFF cung cấp một quy trình kinh tế phù hợp với các tùy chọn sử dụng một lần quy mô nhỏ đến lớn. Do nhu cầu quản lý thay đổi, việc cung cấp các thiết bị hoặc mô-đun tiền vô trùng chiếu xạ gamma được thiết kế để hấp tiệt thúc đẩy việc thích ứng nhanh hơn với các công nghệ dựa trên NFF hoặc TFF.

Nhiều quy trình vắc-xin cổ điển liên quan đến sự phát triển của các hoạt động của đơn vị làm trong, phần lớn là do các ràng buộc về quy định và chi phí cao liên quan đến việc xác nhận lại và nộp lại hoặc thử nghiệm lâm sàng. Quy trình nền tảng sử dụng sơ đồ làm trong dựa trên lọc đã được sử dụng rộng rãi trong một số tác nhân sinh học với mức độ thành công cao. Các ví dụ và trường hợp được nêu trong tài liệu này cho thấy các nhà sản xuất vắc-xin có tiềm năng đạt được mức độ ổn định, khả thi về mặt kinh tế và tiện ích sử dụng một lần này bằng cách áp dụng phương pháp tiếp cận mẫu.

Những lợi thế khác của lọc so với ly tâm là virus nhạy cảm với lực cắt hoặc virus có xu hướng tích tụ ở giao diện không khí. Khi các nhà sản xuất thiết bị đưa sản phẩm mới ra thị trường, các nhà sản xuất vắc-xin sẽ tiếp tục được trang bị tốt hơn cho quy trình làm trong.

 

Là công ty đầu tiên trong mạch bản địa hóa, Guidling Technology đã tích lũy đủ kinh nghiệm liên quan trong việc làm trong vắc-xin. Guidling Technology là một công ty phát triển và sản xuất tập trung vào dược phẩm sinh học và nuôi cấy tế bào, tinh chế và tách. Các sản phẩm được sử dụng rộng rãi trong y sinh học, chẩn đoán, lọc chất lỏng công nghiệp, phát hiện, làm trong, tinh chế và quy trình cô đặc; Guidling đã phát triển thành công ống ly tâm siêu lọc, băng màng siêu lọc/vi lọc, bộ lọc loại bỏ vi-rút, thiết bị lọc dòng tiếp tuyến, chồng màng sâu, v.v., đáp ứng đầy đủ các tình huống ứng dụng của dược phẩm sinh học và nuôi cấy tế bào.

Màng và bộ lọc màng của chúng tôi được sử dụng rộng rãi trong quá trình cô đặc, chiết xuất và tách lọc sơ bộ, lọc vi mô, lọc siêu lọc và lọc nano. Dòng sản phẩm đa dạng của chúng tôi, từ lọc phòng thí nghiệm dùng một lần nhỏ đến hệ thống lọc loại sản xuất, thử nghiệm vô trùng, lên men, nuôi cấy tế bào, v.v., có thể đáp ứng nhu cầu thử nghiệm và sản xuất.