Quá trình cô đặc siêu lọc/lọc lọc xuôi dòng: Làm thế nào để ngăn chặn hiệu quả sự thẩm thấu và mất mát protein mục tiêu

Quá trình cô đặc siêu lọc/lọc lọc xuôi dòng: Làm thế nào để ngăn chặn hiệu quả sự thẩm thấu và thất thoát protein mục tiêu

Trong các quy trình tinh chế tiếp theo đối với protein tái tổ hợp, các sản phẩm máu và các sản phẩm sinh học khác, siêu lọc/lọc lọc (UF/DF) được sử dụng để cô đặc nguyên liệu, trao đổi đệm và loại bỏ muối cũng như các tạp chất phân tử nhỏ. Sự phân tách đạt được dựa trên quá trình sàng lọc màng: các phân tử lớn như kháng thể đơn dòng (mAbs) được màng giữ lại, trong khi muối, nội độc tố, protein tế bào chủ tự do (HCP) và các tạp chất phân tử nhỏ-nhỏ khác đi qua màng và được loại bỏ trong chất thấm qua. Trong quá trình-mở rộng quy trình, việc mất protein mục tiêu qua màng có thể dễ dàng xảy ra, trực tiếp làm giảm năng suất và tăng chi phí lô. Trong một số điều kiện vận hành, protein có thể được phát hiện trong chất thấm, đòi hỏi phải xác định nhanh xem các thành phần bị rò rỉ có phải là mAb đích còn nguyên vẹn, các tập hợp bị phân hủy/phân mảnh hay protein của tế bào chủ hay không. Bài viết này được chia thành hai phần chính: đánh giá các phương pháp kiểm soát quy trình-truyền thống và kết hợp với Thiết kế thử nghiệm (DOE), thiết lập một cửa sổ quy trình mạnh mẽ, được hỗ trợ bởi nhiều phương pháp phân tích để xác định danh tính của protein được phát hiện trong chất thấm qua.

 

 

I. Nguyên nhân chính dẫn đến sự thẩm thấu protein mục tiêu qua màng trong quá trình UF/DF

1. Áp lực xuyên màng quá mức (TMP)
Khi chênh lệch áp suất qua màng quá cao, lực cản của dung môi được tăng cường, buộc một số protein đơn phân vào trong chất thấm. Trong quá trình-mở rộng quy mô, thùng cấp liệu chứa khối lượng vật liệu lớn hơn và sự dao động áp suất trong đường ống rõ rệt hơn, khiến cho khả năng xảy ra quá áp nhất thời cao hơn so với ở quy mô phòng thí nghiệm.

2. Tốc độ dòng tiếp tuyến không phù hợp
Nếu tốc độ dòng chảy quá thấp, lớp phân cực-nồng độ dày đặc sẽ hình thành trên bề mặt màng và nồng độ protein cục bộ có thể vượt quá ngưỡng dung nạp của màng. Nếu tốc độ dòng chảy quá cao, ứng suất cắt có thể gây ra sự phân cắt cấu trúc của mAb, tạo ra các mảnh protein nhỏ hơn có thể tự do đi qua các lỗ màng.

3. Nồng độ protein trong nguyên liệu quá cao
Khi nồng độ protein trong thức ăn quá cao, protein sẽ tích tụ ở bề mặt màng và một số protein đơn phân có thể được đưa vào dịch thấm. Đây là vấn đề thường gặp trong-sản xuất quy mô lớn.

4. Độ pH hoặc độ dẫn nằm ngoài phạm vi quy trình
Những thay đổi về đặc tính điện tích của protein có thể làm giảm bán kính hydrat hóa và kích thước hạt biểu kiến ​​của nó, dẫn đến sự thẩm thấu qua màng bất thường.

5. Sự lão hóa của băng màng, dòng khuếch tán cao hoặc điều hòa sơ bộ không đủ
Các khiếm khuyết vật lý trong hộp màng có thể trực tiếp gây rò rỉ protein và gây ra rủi ro liên quan đến-thiết bị. CIP lặp đi lặp lại với dung dịch kiềm mạnh có thể dần dần làm hỏng vật liệu màng polyethersulfone (PES).

6. Thể tích lọc quá mức
Trong quá trình lọc tách kéo dài, việc rửa dung môi liên tục có thể dần dần mang đi một lượng nhỏ protein đơn phân.

 

II. Các biện pháp thực tế truyền thống để ngăn chặn sự thẩm thấu và mất đi protein mục tiêu

(A) Kiểm soát tham số quy trình

1. Kiểm soát áp suất xuyên màng (TMP)
Xác định giới hạn cảnh báo áp suất trên và thiết lập cảnh báo khóa liên động để ngăn chặn tác động-áp suất cao nhất thời lên lớp màng. Sau khi xác định các thông số cơ bản ở quy mô nhỏ, hãy giảm áp suất vận hành an toàn trong quá trình-mở rộng quy mô sản xuất và đặt ra phạm vi dung sai quy trình thích hợp.

2. Tối ưu hóa tốc độ dòng chảy chéo
Thiết lập lớp ranh giới ổn định và giảm sự phân cực nồng độ ở bề mặt màng thông qua dòng chảy ngang, từ đó giảm thiểu sự tích tụ protein trên bề mặt màng tại nguồn.

3. Hạn chế nồng độ cuối cùng sau khi cô đặc
Xác định giới hạn nồng độ dựa trên đặc tính hóa lý của protein và tránh nồng độ thức ăn quá cao. Đối với mAbs, nồng độ cuối cùng thông thường thường không vượt quá 50 mg/mL; đối với một số mAbs-dễ bị tổng hợp, nên giảm nồng độ hơn nữa.

4. Kiểm soát độ pH và độ dẫn của thức ăn
Duy trì kích thước hạt ngậm nước ổn định của protein và tránh sự co lại của phân tử do rối loạn cường độ axit/bazơ hoặc ion.

(B) Thiết bị và Kiểm soát Vận hành

1. Thực hiện kiểm tra tính toàn vẹn của băng màng trước mỗi mẻ
Tiến hành kiểm tra điểm bong bóng-trước khi sản xuất từng lô để xác định các sợi màng bị đứt. Nên loại bỏ các băng màng bị hư hỏng ngay lập tức để tránh rò rỉ protein liên tục.

2. Chuẩn hóa quy trình làm sạch CIP
Kiểm soát nồng độ NaOH và thời gian tiếp xúc. Sau khi làm sạch bằng kiềm mạnh, cân bằng hoàn toàn vật liệu màng để giảm nguy cơ biến dạng lỗ rỗng của màng.

3. Sử dụng phương pháp lọc máu theo giai đoạn
Sử dụng-khả năng trao đổi đệm thể tích lớn trong giai đoạn đầu để loại bỏ muối và làm chậm tốc độ dòng lọc lọc khi điểm cuối tiến đến gần để giảm lực cản và thất thoát protein.

 

III. Thiết lập không gian thiết kế quy trình thông qua DOE (Đặc tính quy trình QbD; Áp dụng cho việc gửi IND)

1. Sàng lọc nhân tố
Sàng lọc năm thông số chính của quy trình UF/DF (P): áp suất xuyên màng, tốc độ dòng cấp liệu, nồng độ protein ban đầu, pH cấp liệu và nhiệt độ vận hành.
Các biến phản ứng: hiệu suất giữ lại, hàm lượng protein trong chất thẩm thấu, dòng chảy qua màng và tỷ lệ phần trăm khối lượng-phân tử-cao.

Thông qua phân tích ý nghĩa, xác định các yếu tố chính góp phần gây rò rỉ protein.

2. Mô hình hóa bề mặt đáp ứng
Chọn bốn tham số có ý nghĩa cao nhất để xây dựng bề mặt phản hồi và phân tích sự tương tác giữa các tham số. Trong nhiều điều kiện vận hành, một thông số duy nhất có thể vẫn nằm trong phạm vi đủ tiêu chuẩn của nó, trong khi sự kết hợp của hai thông số có thể dẫn đến sự thẩm thấu protein. Không thể xác định được những hiệu ứng tương tác như vậy thông qua các thử nghiệm một-yếu tố-tại một-một-truyền thống. Dựa trên mô hình, xác định một không gian thiết kế có thể hoạt động được. Miễn là các thông số quy trình vẫn nằm trong phạm vi này, việc lưu giữ protein hiệu quả có thể được đảm bảo trong khi các tạp chất được loại bỏ bằng quá trình lọc tuần hoàn.

3. Thử thách trường hợp-xấu nhất (bắt buộc để mô tả đặc tính của quy trình)
Chọn các tham số quy trình ở các điểm cực trị của ranh giới vận hành để mô phỏng sự biến đổi trong sản xuất: TMP tối đa, tốc độ dòng chảy ngang tối thiểu và nồng độ protein giới hạn-trên. Xác minh rằng ngay cả trong điều kiện vận hành khắc nghiệt,-sự thất thoát protein mục tiêu trên quy mô lớn không xảy ra, nhờ đó đáp ứng các yêu cầu đánh giá của CMC.

 

IV. Nhiều phương pháp phân tích để xác định protein được phát hiện trong mAb thấm và phân biệt mục tiêu, các mảnh phân hủy và HCP

Dựa trên hiệu quả phân tích, chi phí và các tình huống nộp quy định, các phương pháp có thể được chia thành hai loại: sàng lọc nhanh và thử nghiệm xác nhận. Các phương pháp nhanh cần được ưu tiên để giám sát quy trình thường xuyên; khi xảy ra sai lệch bất thường, phải sử dụng các phương pháp nhận dạng chính xác.

1. Đo quang phổ UV (sàng lọc trực tuyến nhanh chóng; được ưu tiên để giám sát-sàn cửa hàng thông thường)
Thu thập chất thấm và đo độ hấp thụ A280 của nó. Điều này chỉ có thể xác định xem protein có trong dịch thấm hay không và không thể phân biệt được loại protein. Nó chủ yếu được sử dụng để theo dõi quá trình thường xuyên. Giá trị A280 tăng liên tục cho thấy tình trạng rò rỉ protein ngày càng trầm trọng và yêu cầu ngừng ngay lập tức quá trình lọc máu và kiểm tra quy trình.

2. Điện di TRANG SDS- (phương pháp nhận dạng định tính được sử dụng phổ biến nhất)
Sử dụng phương pháp điện di khử và{0}}khử và so sánh vị trí dải với vị trí của mAb mục tiêu trong nguyên liệu thô:
1) Nếu vị trí dải hoàn toàn phù hợp với mAb mục tiêu thì mAb nguyên vẹn đã thấm vào màng.
2) Nếu xuất hiện dải trọng lượng-phân tử{2}} thấp hơn thì protein đã trải qua quá trình phân cắt thủy phân, tạo ra các mảnh mAb.
3) Nếu các dải nằm rải rác với nhiều dải khác nhau thì hầu hết là các protein tế bào chủ (HCP) từ tế bào chủ E. coli/CHO chứ không phải từ sản phẩm đích.

3. Sắc ký loại trừ kích thước-hiệu suất cao (HPSEC)
Tách các thành phần theo kích thước phân tử và so sánh thời gian rửa giải của chúng với thời gian của sắc ký đồ nguyên liệu:
- Đỉnh chính có cùng thời gian lưu với mAb cho biết protein mục tiêu còn nguyên vẹn.
- Quá trình rửa giải cực đại trước đó biểu thị các tập hợp/mảnh có trọng lượng-phân tử-cao.
- Quá trình rửa giải cực đại sau đó cho thấy các mảnh phân hủy có trọng lượng-phân tử- thấp.
- Việc không có đỉnh chính đặc trưng cho thấy protein tạp chất HCP.
Phương pháp này có thể cung cấp dữ liệu định lượng và có thể được đưa vào báo cáo điều tra sai lệch quy trình; nó có sự chấp nhận cao trong các tài liệu đệ trình lâm sàng.

4. Xét nghiệm bộ kit ELISA protein tế bào-của máy chủ HCP
Nếu phát hiện thấy protein trong dịch thấm, kết quả ELISA tăng cao và HPSEC không hiển thị đỉnh mAb đặc trưng thì về cơ bản, vật liệu bị rò rỉ có thể được xác định là protein tế bào chủ CHO. Điều này cho thấy việc loại bỏ tạp chất không hoàn toàn trong quá trình tinh chế ngược dòng; các tạp chất được rửa sạch trong giai đoạn UF/DF và không gây thất thoát sản phẩm.

5. Xác minh sắc ký ái lực (Sắc ký protein A)
Protein A liên kết đặc hiệu với vùng Fc của mAbs. Nạp mẫu thấm vào cột: sự xuất hiện của đỉnh rửa giải đặc trưng cho thấy sự hiện diện của kháng thể đích còn nguyên vẹn; việc không có đỉnh rửa giải chứng tỏ rằng các protein trong dịch thấm đều là các protein tạp chất.

6. Phép đo khối phổ (LC-MS) (khả năng truy xuất nguồn gốc theo chiều sâu; được sử dụng để điều tra các sai lệch lớn của quy trình)
LC-MS có thể phân tích trực tiếp trình tự axit amin và xác định chính xác nguồn gốc của protein. Nó chủ yếu được sử dụng để điều tra những sai lệch khó khăn hoặc bất thường và không được sử dụng như một quy trình thường kỳ trong-kiểm tra kiểm soát quy trình.

V. Hành động khắc phục tương ứng với các kết quả phân tích khác nhau

1. mAb đích còn nguyên vẹn được phát hiện trong chất thấm qua
Giảm áp suất xuyên màng và nồng độ cuối cùng sau khi cô đặc; thu hẹp phạm vi vận hành quy trình dựa trên kết quả DOE; và kiểm tra tính toàn vẹn của băng màng.

2. Các mảnh phân hủy kháng thể được phát hiện trong dịch thấm
Điều tra ứng suất cắt trong suốt quá trình và độ pH cực trị; tối ưu hóa bước bất hoạt virus ngược dòng để giảm sự phân cắt protein.

3. Chỉ có protein tạp chất HCP được phát hiện trong nước thấm
Không cần điều chỉnh các thông số UF/DF. Theo dõi vấn đề trở lại các bước sắc ký trước đó và cải thiện việc loại bỏ tạp chất trong quá trình sắc ký trao đổi ái lực và ion-.

 

VI. Bản tóm tắt

Để ngăn chặn sự rò rỉ protein trong quá trình UF/DF, việc kiểm soát quy trình truyền thống dựa vào kinh nghiệm lịch sử để xác định các thông số điểm riêng lẻ, điều này chỉ có thể giải quyết thỏa đáng việc sản xuất ổn định ở quy mô nhỏ. Để đảm bảo hiệu suất ổn định trong quá trình mở rộng quy trình-theo từng bước, nên sử dụng đặc tính quy trình dựa trên DOE- để thiết lập một không gian thiết kế quy trình có đủ dung sai. Kiểm soát tham số dựa trên khoảng thời gian-có thể bù đắp cho sự biến đổi trong sản xuất. Sau khi phát hiện thấy protein trong chất thấm qua, hệ thống phát hiện tia cực tím đơn giản có thể đưa ra cảnh báo ban đầu, sau đó là điện di, HPSEC và ELISA để truy nguyên và nhận dạng. Điều này cho phép phân biệt chính xác giữa sản phẩm mục tiêu và tạp chất tế bào-chủ, cho phép điều tra nguyên nhân-gốc mục tiêu và thực hiện hành động khắc phục. Đây cũng là thành phần nghiên cứu được tiêu chuẩn hóa hiện có trong tài liệu CMC dành cho các dự án mAb.