Thảo luận ngắn gọn về một số phương pháp độc đáo của chất xơ rỗng trong quá trình thanh lọc cơ thể

Jan 06, 2025

Thể vùi (IB) là các hạt protein mật độ cao, không hòa tan được bọc trong màng hình thành khi các gen ngoại lai được biểu hiện trong tế bào nhân sơ, đặc biệt là ở Escherichia coli. Khi quan sát dưới kính hiển vi, IB là vùng có độ khúc xạ cao, rõ ràng là khác biệt với các thành phần khác trong tế bào chất.

Sự hình thành thể vùi tương đối phức tạp, liên quan đến tốc độ sản xuất protein trong tế bào chất, nồng độ peptide mới được tạo ra cao và không có đủ thời gian để gấp lại, tạo thành các tập hợp protein vô định hình. Các thể vùi về cơ bản bao gồm các protein, hơn 50% trong số đó là các sản phẩm nhân bản. Cấu trúc chính của các sản phẩm này là hoàn toàn chính xác, nhưng cấu hình ba chiều sai nên không có hoạt động sinh học. Kích thước thể vùi là 0.5-1μm, không tan trong nước, chỉ tan trong các chất biến tính như urê, guanidine hydrochloride, v.v.

Ở E. coli, thể vùi có thể xuất hiện ở hai vị trí của tế bào: tế bào chất và tế bào chất ngoại vi. Vị trí và đặc điểm của thể vùi trong tế bào phụ thuộc vào cách thức biểu hiện của protein.

Các thể vùi trong tế bào chất của E. coli thường có đường kính từ {{0}}.2 đến 1,5μm và các protein khác nhau có đường kính khác nhau, chẳng hạn như kích thước của interferon là 0,811μm và kích thước của prorennet là 1,281μm. Trong một số trường hợp, đường kính của một số thể vùi lớn hơn đường kính của E. coli, khiến cho E. coli nhô ra. Nói chung, một tế bào chỉ có một thể vùi.

Quá trình thanh lọc cơ thể bao gồm nói chung là:

Công nghệ nghiền tế bào chung là: nghiền mô tốc độ cao, đồng nhất hóa thủy tinh, xử lý siêu âm, phương pháp đông lạnh lặp lại, xử lý hóa học (thường sử dụng xử lý lysozyme).

Thể vùi là các hạt rắn không hoạt động được hình thành do sự ngưng kết nội bào của các protein do vi khuẩn biểu hiện, thường tồn tại ở dạng vô định hình, không hòa tan. Trong thể vùi, protein mục tiêu thực sự chỉ chiếm khoảng 50% và phần còn lại chứa lipid, lipopolysacarit, axit nucleic và dị protein, liên kết với thể vùi và ảnh hưởng đến quá trình tái tạo của protein thể vùi. Vì vậy, rửa trước khi biến tính là một bước rất cần thiết.

Ngoài ra, việc rửa thể vùi rất hữu ích để tăng hiệu suất tái tổ hợp của protein tái tổ hợp. Bằng cách loại bỏ tạp chất, những trở ngại trong quá trình tái tạo có thể được giảm bớt, do đó protein có thể được gấp lại và lắp ráp chính xác một cách hiệu quả hơn, từ đó cải thiện hoạt động và chức năng của protein‌.

Quá trình giặt thường sử dụng ít hơn 1% chất tẩy rửa trung tính, chẳng hạn như Tween, Triton, Urê và NP40 cộng với EDTA và các chất khử 2-mercaptotreitol (DTT), -mercaptoetanol được lặp đi lặp lại nhiều lần vì khả năng giặt của chất tẩy rửa được tăng cường bằng Khi cường độ ion của dung dịch tăng lên, trong quá trình rửa các thể vùi có thể thêm NaCl để tăng cường độ ion.

Các thể vùi có thể được sử dụng để loại bỏ các thành phần khác của dung dịch phân hủy tế bào bằng cách ly tâm hoặc lọc, cả hai phương pháp này đều tận dụng các đặc tính vật lý khác nhau của các thể vùi.

Các protein của thể vùi đặc hơn nhiều so với cùng một thể tích các mảnh tế bào, do đó thể vùi có thể được tách ra khỏi phần còn lại của tế bào bằng phương pháp ly tâm. Ly tâm liên tục là hoạt động được sử dụng thường xuyên nhất để thu được các thể vùi trong sản xuất công nghiệp. Do mật độ của các mảnh tế bào nhỏ hơn mật độ của thể vùi nên tốc độ lắng đọng cũng nhỏ hơn so với thể vùi. Huyền phù và ly tâm liên tục có thể ly tâm hầu hết thể vùi, trong khi các mảnh tế bào được loại bỏ dần dần.
Lọc (lọc dòng tiếp tuyến): Do kích thước phân tử khác nhau của thể vùi và protein hòa tan, phương pháp lọc có thể được sử dụng, giúp giảm chi phí vận hành và giúp dễ dàng mở rộng quy mô. Lọc dòng tiếp tuyến (TFF) được điều khiển bởi sự chênh lệch áp suất xuyên màng. Các chất và tạp chất nhỏ hơn kích thước lỗ màng sẽ đi qua màng, trong khi các tạp chất như tế bào có hạt lớn hơn sẽ bị giữ lại. Khẩu độ màng thường được sử dụng để rửa lọc là 0.1μm. Vi lọc dòng tiếp tuyến sợi rỗng có thể xử lý trực tiếp hàm lượng chất rắn cao của vật liệu lỏng, ít bước hơn, vận hành đơn giản, màng có thể được sử dụng nhiều lần thông qua việc làm sạch, giảm chi phí đầu tư và vận hành thiết bị, phù hợp với yêu cầu sản xuất tự động theo mô-đun.

Sau đây là trường hợp ứng dụng để rửa cơ thể bằng cách sử dụng cột sợi rỗng Guidling.

Chúng tôi đã sử dụng sợi rỗng 94cm2 0.1-0.45μm để cô đặc 250mL chất lỏng (trọng lượng phân tử protein mục tiêu là 17kd). Trong toàn bộ quá trình rửa, tốc độ phục hồi của sự suy giảm dòng protein và màng mục tiêu đã được nghiên cứu.

0-71phút là quá trình cô đặc, 71-224phút là quá trình rửa và lọc. Trong toàn bộ quá trình vi lọc, TMP tăng dần, tốc độ đầu vào của chất lỏng không thay đổi và dòng vật liệu trung bình là 12LMH.

Kết quả cho thấy protein mục tiêu đã bị giữ lại hoàn toàn và tỷ lệ thu hồi protein mục tiêu là hơn 90%. Cột sợi rỗng dẫn hướng ổn định và phù hợp cho ứng dụng này.

Các thể vùi thường được hòa tan trong điều kiện chất biến tính urê hoặc guanidine hydrochloride, và các protein của thể vùi hòa tan bị biến tính hoàn toàn, nghĩa là, ngoại trừ cấu trúc chính và liên kết cộng hóa trị được giữ lại, tất cả các liên kết hydro và liên kết kỵ nước đều bị phá hủy và kỵ nước chuỗi bên được bộc lộ hoàn toàn.

Urê và guanidine hydrochloride là những chất biến tính có độ bền trung bình, dễ dàng loại bỏ bằng cách lọc máu và siêu lọc. Nồng độ chung của urê 8-10M, guanidine hydrochloride 6-8M. Việc hòa tan urê có ưu điểm là không ion hóa, trung tính, chi phí thấp, loại bỏ protein sau khi tái tạo sẽ không gây ra lượng lớn kết tủa protein và các thể hòa tan có thể được tinh chế bằng nhiều phương pháp sắc ký nên đã được sử dụng rộng rãi .

Protein tái tổ hợp hòa tan phải được gấp lại một cách chính xác để tạo thành protein chức năng. Các kỹ thuật tái sinh bao gồm pha loãng dung dịch protein đến gần trung tính, loại bỏ chất biến tính, tái sinh trên cột và sắc ký lọc gel. Trong số đó, pha loãng dung dịch protein đến gần trung tính và loại bỏ chất biến tính là phương pháp tái sinh cổ điển phổ biến, đặc biệt phương pháp tái sinh pha loãng có tỷ lệ sử dụng cao nhất.

Loại bỏ chất biến tính:

Lọc máu: Ưu điểm là thể tích không tăng, tốc độ loại bỏ chất biến tính được kiểm soát bằng cách giảm dần nồng độ của chất lỏng thấm bên ngoài, nhưng mất nhiều thời gian và dễ hình thành các tập hợp protein không hoạt động, không thích hợp cho hoạt động ở quy mô lớn và không thể áp dụng vào quy mô sản xuất.

Siêu lọc (TFF): dễ dàng kiểm soát tốc độ lọc máu, dù trong nghiên cứu và phát triển, thử nghiệm thí điểm hay sản xuất, có thể loại bỏ các chất biến tính (thay đổi chất lỏng + nồng độ) thông qua siêu lọc (TFF).

Các phương pháp tinh chế protein sau khi tái sinh tương tự như các phương pháp tinh chế protein hòa tan, cụ thể là sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel, sắc ký ái lực, kết tủa muối amoni sunfat, v.v..

Thể vùi không có hoạt động sinh học, không cần lo lắng về việc mất hoạt động của protein và lượng biểu hiện lớn sẽ không dẫn đến chết tế bào và tối đa hóa khả năng chống lại sự tấn công của protease. Sợi rỗng cắt ghép có thể được áp dụng linh hoạt trong quá trình tinh chế các thể vùi ở hạ lưu. Trong bước rửa cơ thể, hiệu suất tuyệt vời, so với rửa ly tâm, việc sử dụng sợi rỗng vi lọc công nghệ chín tuổi để rửa lọc dòng tiếp tuyến có thể rút ngắn đáng kể thời gian xử lý và tỷ lệ thu hồi chung có thể đạt hơn 90%. Sợi rỗng jiuling cũng có thể được sử dụng trong bước tái tạo protein của thể vùi. Độ đục của chất lỏng thức ăn được lọc bằng sợi rỗng vi lọc sẽ giảm đáng kể và tỷ lệ thu hồi protein cao; Việc sử dụng sợi rỗng siêu lọc không chỉ có thể loại bỏ chất biến tính mà còn rút ngắn thời gian nạp mẫu sắc ký, để tiết kiệm thời gian, giảm thể tích chất độn và giảm chi phí sản xuất. Tốc độ thu hồi của sợi rỗng vi lọc/siêu lọc thay đổi tùy theo các vật liệu khác nhau và tốc độ thu hồi chung có thể đạt tới 90-95%.

Công nghệ hướng dẫn hoan nghênh bạn yêu cầu bộ dụng cụ kiểm tra để đánh giá liên quan.

Công nghệ hướng dẫn là một doanh nghiệp công nghệ cao quốc gia tập trung vào dược phẩm sinh học, nuôi cấy tế bào, tinh chế và tập trung y sinh, chẩn đoán và chất lỏng công nghiệp. Chúng tôi đã phát triển thành công các thiết bị lọc ly tâm, băng siêu lọc & vi lọc, bộ lọc vi rút, hệ thống TFF, bộ lọc sâu, sợi rỗng, v.v. Đáp ứng đầy đủ các kịch bản ứng dụng của dược phẩm sinh học, nuôi cấy tế bào, v.v. Màng và bộ lọc màng của chúng tôi được sử dụng rộng rãi trong quá trình cô đặc, chiết xuất và tách tiền lọc, vi lọc, siêu lọc và lọc nano. Nhiều dòng sản phẩm của chúng tôi, từ lọc nhỏ trong phòng thí nghiệm sử dụng một lần đến hệ thống lọc sản xuất, kiểm tra độ vô trùng, lên men, nuôi cấy tế bào, v.v., đáp ứng nhu cầu thử nghiệm và sản xuất. Guidling Technology rất mong được hợp tác cùng các bạn!

Một cặp: Nghiên cứu đặc tính quy trình của Cassette màng siêu lọc trong lĩnh vực dược phẩm sinh học (Phần 1)

Tiếp theo: Vấn đề ổn định và giải pháp của thuốc sinh học trong quá trình sản xuất