Chia sẻ văn học|Nói lời tạm biệt với thanh lọc phức tạp? Phương pháp chất hoạt động bề mặt TFF + mới giúp cải thiện hiệu quả và giảm chi phí trong sản xuất vector AAV

Liệu pháp gen đang phát triển nhanh chóng, nhưng chi phí cao của nó vẫn là một rào cản lớn ngăn chặn sự tiếp cận của bệnh nhân rộng hơn. Trong số các trình điều khiển chính của chi phí này là quá trình sản xuất phức tạp của các vectơ virus liên kết (AAV) của Adeno -. Một nghiên cứu được công bố trong Công nghệ sinh học và sinh học đã phát triển một phương pháp tinh chế mới kết hợp lọc dòng chảy tiếp tuyến (TFF) với các chất hoạt động bề mặt, hứa hẹn sẽ đơn giản hóa quá trình tinh chế AAV và giảm chi phí. Hãy đi sâu vào nghiên cứu này do một nhóm từ Đại học Tokyo dẫn đầu.

 

1. Bối cảnh nghiên cứu: Những thách thức và tình trạng hiện tại của thanh lọc AAV

Các vectơ AAV đã trở thành các công cụ phân phối "sao" trong liệu pháp gen do sự an toàn cao, khả năng miễn dịch thấp, khả năng lây nhiễm cả phân chia và không - Các tế bào phân chia và khả năng biểu hiện gen dài hạn-. Tuy nhiên, quá trình sản xuất của họ rất phức tạp, đặc biệt là các bước tinh chế xuôi dòng, thường liên quan đến nhiều vòng ly tâm và sắc ký. Các phương thức này là thời gian - tiêu thụ, lao động - chuyên sâu, khó mở rộng và tốn kém.

Ở quy mô phòng thí nghiệm, tinh chế thường phụ thuộc vào siêu ly tâm gradient clorua clorua hoặc iodixanol, rất khó khăn để mở rộng quy mô cho sản xuất công nghiệp. Sắc ký ái lực ngày càng được sử dụng, nhưng các điều kiện rửa giải pH thấp mà nó yêu cầu có thể làm giảm khả năng lây nhiễm virus. Do đó, việc phát triển một phương pháp tinh chế AAV đơn giản, hiệu quả, nhẹ nhàng và có thể mở rộng là rất quan trọng.

Lọc dòng tiếp tuyến (TFF) là một kích thước - Kỹ thuật tách dựa trên thường được sử dụng để tập trung và đệm - trao đổi các sản phẩm sinh học. Tuy nhiên, TFF thông thường có khả năng hạn chế để loại bỏ các tạp chất như protein tế bào chủ (HCP) và DNA trong quá trình tinh chế AAV, thường để lại các tập hợp protein.

 

2. Cách tiếp cận sáng tạo: TFF kết hợp với chất hoạt động bề mặt để tinh chế hiệu quả

Để khắc phục những hạn chế của TFF truyền thống, các nhà nghiên cứu Rimi Miyaoka, Yuji Tsunekawa và các đồng nghiệp tại Đại học Tokyo đã nghĩ ra một chiến lược thông minh: sử dụng các chất hoạt động bề mặt để ức chế tập hợp và tương tác của các protein Itlant NM về kích thước).

Họ đã thử nghiệm ba loại chất hoạt động bề mặt:

• Không - ion:Octyl glucoside
• Anionic:Natri deoxycholate
• Zwitterionic:Chaps

Nghiên cứu cho thấy rằng việc sử dụng một chất hoạt động bề mặt ion không - không hiệu quả. Cả natri deoxycholate anion và chaps zwitterionic đã tăng cường đáng kể việc loại bỏ các protein dư và chúng nhắm mục tiêu các quần thể protein khác nhau. Cuối cùng, kết hợp 0,5% natri deoxycholate với 1% Chaps tạo ra kết quả đáng chú ý, gần như loại bỏ hoàn toàn protein chủ còn lại. Phân tích trang SDS - chỉ cho thấy ba dải protein Capsid rõ ràng (VP1/VP2/VP3).

 

Hình 1. Quá trình tinh chế TFF không có chất hoạt động bề mặt;(A) SDS - Điện di gel trang; (b) Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)

 

Hình 1. Quá trình tinh chế TFF với chất hoạt động bề mặt;(A) SDS - Điện di gel trang;

 

3. Kết quả nghiên cứu: Độ tinh khiết, hoạt động và an toàn cao

1. Loại bỏ tạp chất hiệu quả:Phương pháp mới đạt được 99,98% loại bỏ HCP và loại bỏ DNA 95%, với độ tinh khiết tương đương hoặc vượt quá phương pháp sắc ký ái lực.
2. Cải thiện khả năng lây nhiễm:Các thí nghiệm in vitro cho thấy các vectơ AAV1 được tinh chế bằng phương pháp này các tế bào HEK293 bị nhiễm bệnh này hiệu quả hơn so với các vectơ được tinh chế bằng phép sắc ký ái lực (24,9% so với 20,8%), cho thấy việc bảo tồn hoạt động sinh học của virus tốt hơn.
3. An toàn in vivo tốt:Sau khi tiêm cục bộ các vectơ AAV1 tinh khiết vào cơ xương chuột, không có tình trạng viêm hoặc tổn thương mô đáng kể nào được quan sát sau hai tuần, chứng tỏ sự an toàn trong cơ thể tốt.
4. Khả năng áp dụng serotype rộng:Phương pháp đã tinh chế thành công nhiều kiểu huyết thanh - bao gồm AAV1, AAV5, AAV8 và AAV9-FROM nuôi cấy tế bào. Tuy nhiên, đối với AAV2, chủ yếu tồn tại trong các tế bào lysates với tải trọng tạp chất cao, cần tối ưu hóa hơn nữa.

 

4. Tóm tắt và triển vọng

Nghiên cứu này đã phát triển một quy trình tinh chế AAV đơn giản, nhanh chóng (1,5 giờ), hiệu quả và có thể mở rộng. Bằng cách kết hợp natri deoxycholate và CHAPS, nó đã giải quyết thành công thách thức của tập hợp protein còn lại trong quá trình tinh chế TFF.

Ưu điểm của phương pháp bao gồm:

• Tránh điều kiện pH thấp khắc nghiệt, bảo tồn hoạt động của virus tốt hơn
• Giảm các bước sắc ký, đơn giản hóa quy trình công việc, và tiết kiệm thời gian và chi phí
• Có thể mở rộng dễ dàng, phù hợp cho công nghiệp lớn - Sản xuất quy mô
• Cung cấp một chiến lược mới để tinh chế các sinh học khác như exosome, các loại virus khác và các kháng thể tái tổ hợp

Các hạn chế hiện tại bao gồm phục hồi virus dưới mức tối ưu và không có khả năng tách các nang trống khỏi các hạt virus đầy đủ, cho thấy việc sử dụng tốt nhất của nó có thể là một bước đầu tiên - trong một quy trình tinh chế bước đa -.

Tóm lại, nghiên cứu này cung cấp một tùy chọn mới hấp dẫn cho sản xuất vector AAV ở hạ lưu và có khả năng giảm đáng kể chi phí của thuốc trị liệu gen, tạo điều kiện cho ứng dụng rộng hơn của chúng.