-Làm sạch vi khuẩn ở hạ lưu ở quy mô công nghiệp — Phần 'Làm sạch' và 'Siêu lọc'
Thể thực khuẩn, còn được gọi là thể thực khuẩn, là loại virus lây nhiễm vi khuẩn. Một phage không thể tự mình tồn tại; nó phải ký sinh vào vi khuẩn chủ để sinh sản, cuối cùng khiến vi khuẩn bị ly giải. Do những đặc tính độc đáo của chúng, thể thực khuẩn có thể được sử dụng lâm sàng để xác định và phân loại vi khuẩn, cũng như để điều trị một số bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn khó chữa.
Đây là sơ đồ cấu trúc của thực khuẩn thể (nguồn hình ảnh: internet).
Người ta ước tính rằng bệnh cây trồng gây thiệt hại hơn 30% năng suất cây trồng toàn cầu mỗi năm. Trong số các mầm bệnh khác nhau, bệnh do vi khuẩn đặc biệt khó kiểm soát. Các phương pháp kiểm soát truyền thống chủ yếu dựa vào thuốc kháng sinh và chất-có chứa đồng. Tuy nhiên, việc lạm dụng thuốc kháng sinh đã dẫn đến tình trạng kháng kháng sinh ngày càng nghiêm trọng, trong khi việc sử dụng lâu dài các hợp chất đồng dẫn đến sự tích tụ trong môi trường, gây nguy hiểm cho sức khỏe của con người và động vật.
Vì thực khuẩn có tính đặc hiệu cao nên chúng có thể tiêu diệt có chọn lọc vi khuẩn gây bệnh mà không gây hại cho vi khuẩn có lợi hoặc các tế bào chủ khác. Do đó, thể thực khuẩn có thể đóng vai trò là chất thay thế cho kháng sinh và các tác nhân dựa trên đồng-. Thông qua liệu pháp thể thực khuẩn, mầm bệnh có thể được loại bỏ một cách hiệu quả đồng thời giảm việc sử dụng kháng sinh và các hợp chất đồng.
Với những tiến bộ khoa học công nghệ không ngừng và nghiên cứu sâu hơn về thể thực khuẩn, triển vọng sử dụng thể thực khuẩn để điều trị siêu vi khuẩn ngày càng trở nên hứa hẹn. Trong tương lai, liệu pháp phage được kỳ vọng sẽ trở thành một trong những giải pháp then chốt để giải quyết tình trạng kháng kháng sinh. Thông qua nghiên cứu và khám phá đang diễn ra, liệu pháp thể thực khuẩn có thể nổi lên như một lực lượng chính trong lĩnh vực điều trị bằng kháng sinh, đóng góp lớn hơn cho sức khỏe con người.
Tuy nhiên, để truyền thực khuẩn vào cơ thể con người một cách an toàn và hiệu quả-đặc biệt là qua đường tiêm tĩnh mạch (IV)-vẫn còn một thách thức lớn:cách thu được các chế phẩm thể thực khuẩn cực kỳ tinh khiết.
Lysate phage là một hỗn hợp phức tạp, ngoài các phage đích, còn chứa các tạp chất chính như: vi khuẩn chủ và các mảnh của chúng, DNA bộ gen và protein chủ (tạp chất liên quan đến-vật chủ); nội độc tố như lipopolysaccharides (LPS) (tạp chất liên quan đến quá trình-); và các tạp chất liên quan đến sản phẩm-bao gồm cả viên nang rỗng và phần đuôi bị gãy.
Do đó, mục tiêu của quá trình tinh chế không chỉ là đạt được hiệu giá phage cao mà còn giảm tạp chất-đặc biệt là nội độc tố, DNA vật chủ và protein-xuống mức cực thấp theo quy định của tiêu chuẩn dược điển.
Một quy trình tinh lọc phage mạnh mẽ và có thể mở rộng thường tuân theo các nguyên tắc chung của quá trình xử lý tiếp theo và có thể được chia thành các bước hợp lý sau:
Quá trình thanh lọc xuôi dòng của thực khuẩn
Làm rõ - Loại bỏ tạp chất vĩ mô
Ở giai đoạn đầu của quá trình tinh chế thực khuẩn, mục tiêu chính của bước làm rõ là loại bỏ hiệu quả các tế bào vi khuẩn còn nguyên vẹn và các mảnh vụn tế bào lớn khỏi dịch ly giải thô. Mục đích cốt lõi của bước này là cung cấp nguyên liệu sạch cho các cột sắc ký sau hoặc bộ phận tách màng, giảm thiểu tải lượng các hạt rắn. Điều này ngăn chặn hiệu quả tình trạng tắc nghẽn trong các bộ phận thanh lọc tiếp theo, đảm bảo hoạt động ổn định và hiệu quả xử lý cao trong suốt quy trình thanh lọc.
Trong các quy trình xuôi dòng của thực khuẩn thể truyền thống, quá trình làm sạch thường dựa vào-quy trình ly tâm tốc độ thấp kết hợp với-lọc độ sâu nhiều giai đoạn-thường đi qua tuần tự qua các bộ lọc 0,8μm, 0,45μm và 0,22μm-để loại bỏ hiệu quả các mảnh vụn và tạp chất của tế bào chủ. Mặc dù đã hoàn thiện và đáng tin cậy nhưng cách tiếp cận này bao gồm nhiều bước, tốn-thời gian và yêu cầu chuyển nguyên liệu nhiều lần, tạo cơ hội cho việc tối ưu hóa năng suất và hiệu quả tổng thể.
Thay thế quá trình lọc độ sâu nhiều{0}}giai đoạn bằngviên nang vi lọccó thể đơn giản hóa và tăng cường đáng kể quá trình này. Cụ thể, sau khi loại bỏ hầu hết các mảnh vụn của tế bào thông qua quá trình ly tâm-tốc độ thấp, dịch ly giải có thể được xử lý trực tiếp bằngLọc dòng tiếp tuyến (TFF)sử dụng viên nang vi lọc có kích thước lỗ xác định (0,45μm hoặc 0,22μm). Điều này cho phép loại bỏ tốt các tạp chất dạng hạt và sự thẩm thấu hiệu quả của các phage mục tiêu trongbước đơn, tích hợp hiệu quả ba giai đoạn lọc truyền thống thành một.
Sự đổi mới này không chỉ giúp giảm đáng kể thời gian vận hành và xử lý thủ công mà còn giảm thiểu nguy cơ mất mẫu và ô nhiễm do nhiều bước lọc gây ra, từ đó cải thiện khả năng phục hồi tổng thể của thể thực khuẩn. Trong khi đó, hoạt động của dòng tiếp tuyến giúp giảm thiểu tắc nghẽn màng, tăng cường thông lượng và tăng cường độ bền của quy trình.
Vì vậy, việc áp dụng mộtchiến lược làm rõ tích hợp kết hợp-các viên nang ly tâm tốc độ thấp và vi lọcthể hiện một cách tiếp cận hiệu quả để cải thiện hiệu quả và-hiệu quả chi phí của việc sản xuất-thực khuẩn quy mô lớn. Các viên nang vi lọc của Guidling Technology thường có thể làm giảm độ đục của thức ăn xuống dưới20 NTU, đáp ứng đầy đủ yêu cầu của các bước siêu lọc và sắc ký tiếp theo.
Thu giữ và cô đặc - Làm sạch sơ cấp và giảm thể tích
Trong thời giannắm bắt và tập trunggiai đoạn tinh chế thực khuẩn thể, mục tiêu chính là thu hồi hiệu quả các thể thực khuẩn từ một lượng lớn dịch ly giải đã được làm rõ đồng thời đạt được nồng độ sản phẩm chính và trao đổi đệm. Bước này chủ yếu dựa vàoLọc dòng tiếp tuyến (TFF)công nghệ.
Nguyên tắc của TFF nằm ở việc sử dụng màng siêu lọc có giới hạn trọng lượng phân tử cụ thể-(thường là 100 hoặc 300kDa). Các tạp chất phân tử nhỏ như các thành phần môi trường nuôi cấy còn sót lại, chất chuyển hóa và protein nhỏ đi qua các lỗ màng một cách có chọn lọc, trong khi các phage được giữ lại trong chất giữ lại dohiệu ứng loại trừ kích thước, cho phép phân tách và làm giàu chúng một cách hiệu quả.
Trong hệ thống TFF,chế độ siêu lọcđược sử dụng để đạt được nồng độ thể tích, trong khi chuyển sangchế độ lọc diafiltercho phép trao đổi đệm, từ đó tạo điều kiện hóa lý thích hợp cho các bước tiếp theo như xử lý bằng enzyme.
Công nghệ này mang lại những lợi ích tổng hợp củahiệu quả xử lý caoVàkhả năng mở rộng tuyệt vời, khiến nó trở nên lý tưởng cho-sản xuất quy mô lớn. Theo GuidlingTechnology, viên nang siêu lọc thường đạt được hiệu suấttỷ lệ phục hồi thể thực khuẩn là 90–95%, tùy thuộc vào vật liệu cụ thể được xử lý.
Thanh lọc sâu – Loại bỏ có mục tiêu các tạp chất quan trọng
Trong quá trình tinh sạch thực khuẩn,thanh lọc sâulà khâu quan trọng quyết định chất lượng sản phẩm cuối cùng. Mục tiêu hàng đầu của nó làloại bỏ cụ thể các tạp chất quan trọng, chẳng hạn như nội độc tố. Truyền thốngLy tâm gradient mật độ CsCl-do tính độc hại và thiếu khả năng mở rộng-đã bị loại khỏi các quy trình công nghiệp. Các cách tiếp cận hiện nay tập trung vàocông nghệ dựa trên sắc ký-, với sự tích hợp sáng tạo củatiền xử lý enzyme.
Một chiến lược tiên tiến kết hợpsắc ký trao đổi anion (AEC)vớitiền xử lý phosphatase kiềm (AP)đã được phát triển. Cả thể thực khuẩn và lipopolysacarit (LPS) đều mang điện tích âm, dẫn đến sự cạnh tranh vị trí liên kết trong quy trình AEC thông thường và gây ra hiện tượng đồng rửa giải làm giảm hiệu quả tinh chế. Bằng cách đưa ra phương pháp tiền xử lý AP trước khi nạp AEC, enzyme này đặc biệt loại bỏ các nhóm phốt phát khỏi vùng lipid A và polysacarit lõi của các phân tử LPS, làm giảm đáng kể điện tích âm ròng của chúng. Điều này làm suy yếu hiệu quả ái lực của chúng đối với môi trường trao đổi anion.
Số liệu thực nghiệm cho thấy việc xử lý mẫu bằngAP 20 U/mLtiếp theo là thanh lọc bằng cách sử dụngchất hấp phụ màng phối tử amin bậc bốn (Q) hoặc cột nguyên khốicó thể đạt tớiLoại bỏ nội độc tố 98,8%, trong khi vẫn duy trì tốc độ phục hồi phage tuyệt vời. Cách tiếp cận này giải quyết thành công vấn đề-tồn tại lâu dài về sự hấp phụ đồng-nội độc tố trong quá trình tinh chế phage
Đánh bóng – Tinh chỉnh và xây dựng công thức cuối cùng
Trong trận chung kếtgiai đoạn đánh bóngTrong quá trình tinh chế thực khuẩn, mục tiêu chính là đạt được độ tinh khiết cao nhất và sự sẵn sàng của công thức. Điều này bao gồm việc loại bỏ các tạp chất còn sót lại, loại bỏ các chất phụ gia được đưa vào trong quá trình (chẳng hạn như phosphatase kiềm) và chuyển đổi hoàn toàn sản phẩm thành một hệ thống đệm tương thích với công thức-.
Điều này thường được thực hiện thông qualọc thứ cấp, một phương pháp đã được chứng minh và hiệu quả cho phép loại bỏ sâu-các chất gây ô nhiễm phân tử nhỏ và trao đổi đệm triệt để.
Để nâng cao hơn nữa độ tinh khiết của sản phẩm,sắc ký tương tác liên kết hydro-hoặcsắc ký chế độ hỗn hợp (MMC)có thể được giới thiệu như mộtbước đánh bóng cuối cùng. Những kỹ thuật này sử dụng cơ chế phân tách đa chiều để loại bỏ các thành phần vi lượng có đặc tính hóa lý tương tự như của phage đích. Kết quả là một thành phần dược phẩm hoạt tính thể thực khuẩn (API) có độ tinh khiết cao đáp ứng các tiêu chuẩn chất lượng nghiêm ngặt cần thiết chocông thức cấp độ tiêm-.
Bằng cách chọn kết hợp các mô-đun màng vi lọc và màng siêu lọc với diện tích màng là 1 mét vuông, thể tích vi khuẩn tối đa ước tính có thể được xử lý lên tới 100 L. Dòng vật liệu vi lọc là khoảng 20–50 LMH và dòng vật liệu siêu lọc là khoảng 15–30 LMH. So với các phương pháp xử lý truyền thống, phương pháp này có thể đáp ứng hiệu quả các yêu cầu của quy trình cho cả quá trình làm rõ và siêu lọc.
Tài liệu tham khảo:
Saavedra và cộng sự,Tinh chế có thể mở rộng các chế phẩm vi khuẩn (2025)
Lapras và cộng sự,Hợp lý hóa quy trình tinh chế thành phần dược phẩm có hoạt tính thể thực khuẩn (2024)
