Ứng dụng siêu lọc trong sản xuất vắc xin bệnh dại ở người

Để thúc đẩy ứng dụng siêu lọc trong sản xuất vắc xin phòng bệnh dại cho người, băng màng siêu lọc 300kDa đã được sử dụng để cô đặc dung dịch thu hoạch virus dại và phát hiện khả năng phục hồi kháng nguyên, tốc độ loại bỏ nội độc tố và tốc độ loại bỏ protein của vật chủ sau khi siêu lọc. Kết quả cho thấy dưới áp suất thích hợp, dung dịch thu hoạch virus dại được cô đặc 80 lần, rửa giải 25 lần, tỷ lệ thu hồi kháng nguyên là 86,2%, tỷ lệ loại bỏ nội độc tố vi khuẩn là 87,5% ~ 88,7% và tỷ lệ loại bỏ protein chủ là 91,6%.

 

Lời tựa

 

Bệnh dại là một bệnh lây truyền từ động vật cổ xưa do vi-rút dại (RV) gây ra, với tỷ lệ tử vong lên tới 100%. Hiện tại, không có phương pháp điều trị hiệu quả nào cho tình trạng sau phơi nhiễm (tức là tổn thương da và niêm mạc) ngoài vắc xin khẩn cấp và tiêm chủng globulin miễn dịch. Nguồn bệnh dại chính ở người là vết cắn của động vật bị bệnh hoặc có khả năng bị nhiễm bệnh (chủ yếu là chó). Tỷ lệ tử vong do bệnh dại ở Trung Quốc đứng thứ hai trên thế giới và bệnh dại là một trong những vấn đề đe dọa an ninh y tế công cộng ở nước ta. Glycoprotein dạng nang của vi rút bệnh dại, là kháng nguyên quan trọng duy nhất tạo ra kháng thể trung hòa bảo vệ, là trọng tâm của nghiên cứu và phát triển vắc xin mới cũng như công nghệ chẩn đoán và điều trị mới đối với vi rút bệnh dại.

 

Virus dại thuộc giống virus dại thuộc họ rhabdovirus. Hình dạng của nucleocapsid có tính đàn hồi, nucleocapsid đối xứng xoắn ốc và bề mặt có một lớp vỏ chứa RNA chuỗi đơn. Đó là mầm bệnh gây bệnh dại. Virus dại có hai loại kháng nguyên chính: một là kháng nguyên glycoprotein trên màng ngoài của virus, có thể liên kết với thụ thể acetylcholine làm cho virus gây độc thần kinh và tạo ra kháng thể trung hòa và kháng thể ức chế ngưng kết hồng cầu trong cơ thể và kháng thể trung hòa có tác dụng bảo vệ; Loại còn lại là kháng nguyên riboprotein bên trong, có thể khiến cơ thể sản sinh ra kháng thể liên kết bổ sung và kết tủa, không có tác dụng bảo vệ.

 

Nội độc tố là một loại chất lipopolysacarit (LPS), có khả năng chịu nhiệt và ổn định hóa học và không dễ bị phá hủy. Nếu có một nồng độ nội độc tố nhất định trong vắc xin sẽ gây sốt nặng, thậm chí tử vong sau khi tiêm vắc xin, vì vậy nên giảm hàm lượng nội độc tố trong vắc xin càng nhiều càng tốt. Ấn bản năm 2005 của Dược điển Trung Quốc (Phần III) đã xác định rằng giá trị kiểm soát của chỉ số nội độc tố vắc xin bệnh dại đủ tiêu chuẩn không được cao hơn 100EU/liều. Với sự phát triển nhanh chóng của công nghệ tách màng, việc ứng dụng công nghệ tách màng siêu lọc để giảm hàm lượng nội độc tố trong vắc xin ngày càng trở nên phổ biến trong ngành dược phẩm.

 

Vắc-xin bệnh dại là vắc-xin phòng bệnh dại. Thường có ba loại vắc xin bệnh dại, bao gồm vắc xin tế bào Vero tinh khiết, vắc xin tế bào lưỡng bội ở người và vắc xin nuôi cấy tế bào sơ cấp. Vắc-xin bệnh dại được tạo ra bằng cách cấy vi-rút cố định vi-rút bệnh dại vào ma trận tế bào, sau khi nuôi cấy, thu hoạch, cô đặc, bất hoạt, tinh chế và thêm chất ổn định thích hợp. Chức năng chính của vắc xin bệnh dại là kích thích cơ thể tạo ra phản ứng miễn dịch nhanh và tạo ra kháng thể bảo vệ chống lại vi rút bệnh dại, nhằm ngăn ngừa nhiễm trùng do vi rút gây ra và giảm nguy cơ mắc bệnh.

 

 

Quy trình sản xuất vắc xin đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo chất lượng vắc xin, đặc biệt việc định lượng một số chỉ tiêu trong quá trình sản xuất càng quan trọng hơn. Trong quy trình sản xuất vắc xin phòng bệnh dại cho người, công nghệ cô đặc siêu lọc là phương tiện cần thiết để sản xuất vắc xin phòng bệnh dại cho người. Sử dụng màng siêu lọc có khẩu độ hợp lý để tập trung siêu lọc có thể loại bỏ nội độc tố và protein chủ một cách hiệu quả, đồng thời giữ lại kháng nguyên RV, có lợi cho việc sản xuất và cải thiện chất lượng vắc xin. Khối lượng phân tử tương đối của các phân tử RV là 350kDa ~ 460kDa, và về lý thuyết, RV có thể bị giữ lại hoàn toàn bởi nồng độ siêu lọc bằng cách sử dụng băng màng có trọng lượng phân tử đánh chặn là 100kDa và 300kDa. Nội độc tố thường hình thành cấu trúc tổng hợp trong các dung dịch nước khác nhau, do mức độ kết tụ, kích thước phân tử khác nhau. Khối lượng phân tử tương đối của monome nội độc tố là 10kDa ~ 20kDa và khối lượng phân tử tương đối của dạng trùng hợp của nó là 300kDa ~ 1000kDa hoặc hơn 1000kDa. Dựa trên sự khác biệt về trọng lượng phân tử, kháng nguyên RV trong vắc xin phòng bệnh dại ở người được giữ lại và nội độc tố và protein chủ trong vắc xin bệnh dại ở người được loại bỏ bằng màng siêu lọc 300kDa.

 

Trong thí nghiệm này, băng cassette màng siêu lọc có khẩu độ 300kDa và diện tích màng 0,11m2 được sử dụng làm mẫu xử lý nhỏ để cô đặc các sản phẩm trung gian vắc xin bệnh dại ở người và dòng màng, hiệu quả xử lý, bội số nồng độ, chặn kháng nguyên, loại bỏ nội độc tố và việc loại bỏ protein chủ đã được thử nghiệm.

 

2Phương pháp vật liệu

 

2.1 Vật liệu thí nghiệm

Virus dại cố định virus CTN-IV; tế bào Vero; 0.5M natri hydroxit; 30Kẹp màng siêu lọc 0kDa (vật liệu PES, diện tích màng 0,11m²).

 

2.2 Phương pháp thí nghiệm

2.2.1 Chuẩn bị dung dịch thu hoạch virus

Tế bào Vero đông lạnh được hồi sinh trong nước ấm ở nhiệt độ 37 độ ~ 39 độ, huyền phù tế bào được hút ra, sau đó được thêm vào 199 môi trường nuôi cấy chứa 10% huyết thanh bê bất hoạt. Các tế bào đơn lớp đồng nhất được nuôi cấy ở 37 độ. Chủng CTN-IV được tiêm vi rút dại với tỷ lệ 0,1mol/L và nuôi cấy ở nhiệt độ 37 độ. Sau 48 giờ, môi trường nuôi cấy được loại bỏ và môi trường nuôi cấy 199 chứa 0,1% albumin máu người được thêm vào để duy trì môi trường nuôi cấy ở 33 độ ~ 35 độ. Thu hoạch nọc độc bệnh 3 ngày một lần{16}}và kết hợp nhiều chất lỏng thu hoạch.

 

2.2.2 Lắp đặt khay màng

Lắp hộp màng và nối dây như minh họa trong hình bên dưới.

 

2.2.3 Rửa nước

Đóng van đầu vào, van hồi lưu và van thông, đồng thời lắp đầu hồi và ống cuối vào thùng chứa chất lỏng thải. Đổ đầy bình nạp 1L nước để tiêm.

Mở van đầu vào và van hồi, đóng van thông, mở máy bơm, làm sạch đường hồi bằng 10% thể tích nước tinh khiết hoặc nước pha phun và duy trì áp suất đầu vào ở mức 0,35bar (5psi).

Mở van lọc, đóng van hồi và dùng lượng nước phun còn lại để làm sạch ống lọc, duy trì TMP ở 0.35bar.

 

2.2.4 Khử trùng

Đóng van đầu vào, van hồi lưu và van truyền động, đồng thời lắp đường dây hồi lưu và đầu truyền động vào thùng chứa chất thải. Đổ đầy bình nạp 2L dung dịch tẩy rửa.

Mở van đầu vào và van hồi lưu, đóng van thông qua, mở máy bơm, làm sạch đường hồi lưu bằng 200mL natri hydroxit 0,5M và duy trì áp suất đầu vào ở mức 0,35bar (5psi) .

Mở van thông, đóng van hồi và làm sạch đường ống thông với thể tích dung dịch làm sạch 200mL, duy trì TMP ở mức 0,35bar.

Sau đó, đầu hồi và ống xuyên qua được đưa vào bể chứa chất lỏng để làm sạch theo chu kỳ. Làm sạch theo chu kỳ với tốc độ dòng tiếp tuyến gấp 1 ~ 1,5 lần trong 30 phút.

Xả 0,5M natri hydroxit và rửa bằng nước pha tiêm theo 2.2.4 cho đến khi trung tính.

 

2.2.5 Thử nghiệm dòng nước

Thêm nước tinh khiết vào bể nạp, đo và ghi lại nhiệt độ nước trong bể nạp. Lắp đầu hồi vào bể. Khởi động máy bơm và điều chỉnh tốc độ máy bơm cũng như van hồi lưu để đạt được chênh lệch áp suất xuyên màng 0,35bar (5psi). Dùng ống đong, đo và ghi lại tốc độ dòng chảy qua đầu cuối, tính bằng mL/min. Điều chỉnh tốc độ bơm và van hồi lưu để đạt được áp suất chênh lệch xuyên màng 1bar (15psi). Dùng ống đong, đo và ghi lại tốc độ dòng chảy qua đầu cuối, tính bằng mL/min.

Để chuẩn hóa giá trị lưu lượng nước, chia giá trị lưu lượng nước tính được cho chênh lệch áp suất xuyên màng và nhân hệ số hiệu chỉnh nhiệt độ trong bảng sau.

 

2.2.6 Nồng độ siêu lọc

Rửa sạch nước ra khỏi hệ thống bằng đệm trên. Chu kỳ trong 5 phút để điều chỉnh độ pH và độ ổn định ion của hệ thống. Nếu cần điều chỉnh nhiệt độ, hãy tiếp tục chu trình cho đến khi nhiệt độ hệ thống ổn định.

Thêm chất lỏng cấp vào bể nạp, đặt tốc độ dòng cấp (ví dụ 400LMH) và kiểm tra tốc độ dòng chảy qua ở các giá trị TMP khác nhau. Theo dữ liệu thử nghiệm, các đường cong được vẽ bằng TMP là trục hoành và Flux là tọa độ.

Hướng ống xuyên qua vào thùng chứa hoặc cống thoát nước thích hợp, chẳng hạn như bể thu gom xuyên suốt, bể chứa chất lỏng thải và cống xử lý.

Ghi lại trọng lượng ban đầu của chất lỏng cấp liệu trong thùng cấp liệu, khởi động bơm cấp liệu và luân chuyển từ từ chất lỏng cấp liệu trong 3 phút đến 4 phút. Tuần hoàn có thể giúp loại bỏ không khí dư trong đường dẫn dòng chảy, từ đó tối đa hóa hiệu suất của màng.

Mở van thông qua, tăng từ từ tốc độ bơm cho đến khi đạt được tốc độ dòng tiếp tuyến tối ưu và điều chỉnh van hồi lưu để đạt được TMP tối ưu của hệ thống.

Sau đó đặt ống vào thùng chứa, bắt đầu tính thời gian khi chất lỏng đi vào thùng chứa, đồng thời ghi lại áp suất đầu vào và áp suất quay trở lại trong những khoảng thời gian thích hợp, đồng thời ghi lại chất lượng của chất lỏng theo thời gian ở đầu hồi và đầu xuyên qua để tính toán tức thời lưu lượng dòng chảy.

Nồng độ siêu lọc của mẫu được hoàn thành khi thể tích chất lỏng của nguyên liệu giảm xuống thể tích nồng độ mục tiêu.

 

2.2.7 Chạy thận

Đặt ống nạp, ống bổ sung và ống hồi vào bình nạp, đặt ống truyền động vào thùng thu gom và đặt thùng thu gom lên cân cho sạch.

Mở van hồi lưu, khởi động bơm đầu vào, mở van thông qua, điều chỉnh tốc độ bơm và TMP về giá trị thích hợp. Mở bơm bổ sung, giữ nguyên thể tích chất lỏng trong bình nạp và bắt đầu lọc máu với thể tích bằng nhau. Bắt đầu tính thời gian khi chất lỏng đi vào bình chứa và ghi lại áp suất ở đầu vào, đầu hồi và khối lượng của chất lỏng ở khoảng thời gian thích hợp và tính toán tốc độ dòng chảy tức thời.

 

2.2.8 CIP

Đầu tiên rửa sạch bằng dung dịch đệm, sau đó rửa bằng nước pha tiêm (thao tác 2.2.3), sau đó làm sạch bằng chất tẩy rửa (thao tác 2.2.4), và cuối cùng rửa sạch bằng nước pha tiêm (thao tác 2.2.3).

 

2.2.9 Thử dòng nước

Thao tác thực hiện như sau: 2.4.5.

 

2.2.10 Bảo quản khay màng

Bảo quản ngắn hạn (Nhỏ hơn hoặc bằng 3 ngày), giữ băng màng trong thiết bị cố định và sử dụng dung dịch bảo quản để quay vòng trong 10 phút đến 15 phút, đóng van hệ thống, cắt nguồn điện cho bơm chất lỏng và đảm bảo rằng bể chứa chất lỏng được bịt kín đúng cách.

Nếu thời gian bảo quản là 3 ngày đến 1 tháng, vui lòng tháo hộp màng ra khỏi thiết bị cố định và niêm phong vào túi nhựa hoặc hộp kín khác. Thêm khoảng 50mL đến 100mL dung dịch bảo quản vào túi nhựa hoặc hộp kín và đậy kín. Hoặc có thể ngâm trực tiếp vào dung dịch bảo quản. Bảng sau đây khuyến nghị các điều kiện bảo quản.

 

3 Kết quả và phân tích

 

3.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả loại bỏ pyrogen

Áp suất vận hành siêu lọc: 15 mẻ thử nghiệm được chạy liên tục. Trong mỗi mẻ, áp suất lọc được duy trì ở mức 5, 10, 15 và 2{{1{12}}}}psi trong quá trình siêu lọc và chất lỏng thu hoạch vi rút được cô đặc 30 lần và rửa giải bằng chất lỏng đệm (gấp 10 lần âm lượng) trong dòng chảy liên tục. Kết quả như trong bảng dưới đây, tỷ lệ loại bỏ nội độc tố dưới 87,0%, tỷ lệ thu hồi kháng nguyên ổn định ở mức 86,0% và tỷ lệ loại bỏ protein chủ ổn định ở mức 90,0%, cho thấy rằng áp suất vận hành khác nhau ít ảnh hưởng đến hiệu quả thu hồi kháng nguyên, loại bỏ nội độc tố và loại bỏ protein chủ.

Tỷ lệ nồng độ siêu lọc: 15 mẻ thử nghiệm được chạy liên tục. Trong mỗi mẻ, chất lỏng thu hoạch vi rút được cô đặc lần lượt 3{12}} lần, 5{14}} lần, 80 lần và 100 lần trong quá trình siêu lọc. Áp suất lọc được duy trì ở mức 20psi và chất lỏng đệm (gấp 10 lần thể tích) được rửa giải bằng dòng chảy liên tục. Kết quả như bảng sau, tỷ lệ loại bỏ nội độc tố dao động từ 53,3% đến 86,9%, tỷ lệ thu hồi kháng nguyên duy trì ổn định ở mức 86,0% và tỷ lệ loại bỏ protein chủ ổn định ở mức 91,0%. Trong lấy mẫu phân đoạn, không phát hiện thấy kháng nguyên trong dung dịch truyền và dưới 10% protein chủ vẫn còn trong dung dịch virus cô đặc. Nồng độ nội độc tố trong dung dịch virus đậm đặc tăng lên khi tăng thời gian tập trung và tốc độ loại bỏ nội độc tố cao nhất trong mẫu cô đặc là 80 lần và nhà sản xuất cũng có thể xem xét nồng độ 100 lần, không chỉ nâng cao hiệu quả sản xuất, giảm giá thành mà còn đáp ứng yêu cầu sản xuất vắc xin.

 

3.2 Sự suy giảm thông lượng băng cassette màng và tái tạo làm sạch

Sau khi xử lý, tỷ lệ thu hồi thông lượng màng là 92,6%. Tốc độ phục hồi đầu tiên của băng màng mới là bình thường, theo đặc tính quan sát hiện tại của chất lỏng cấp liệu, dự đoán tiếp theo của lần thứ hai và NTH, tốc độ phục hồi từ thông băng băng màng sẽ gần với dữ liệu sau quá trình xử lý này, và có xu hướng ổn định. Trong vòng 2 giờ sau khi sử dụng một lần, lượng băng màng bị cạn kiệt là lý tưởng và chỉ có 10% dòng màng bị cạn kiệt trong quá trình vận hành tổng thể.

3.2.1 Sự suy giảm chất trợ dung trong quá trình xử lý băng màng

3.2.2 Kết quả làm sạch và tái sinh cassette màng

 

Về hướng dẫn

 

Công nghệ hướng dẫn là một doanh nghiệp công nghệ cao quốc gia tập trung vào dược phẩm sinh học, nuôi cấy tế bào, tinh chế và tập trung y sinh, chẩn đoán và chất lỏng công nghiệp. Chúng tôi đã phát triển thành công các thiết bị lọc ly tâm, băng siêu lọc & vi lọc, bộ lọc vi rút, hệ thống TFF, bộ lọc sâu, sợi rỗng, v.v. Đáp ứng đầy đủ các kịch bản ứng dụng của dược phẩm sinh học, nuôi cấy tế bào, v.v. Màng và bộ lọc màng của chúng tôi được sử dụng rộng rãi trong quá trình cô đặc, chiết xuất và tách tiền lọc, vi lọc, siêu lọc và lọc nano. Nhiều dòng sản phẩm của chúng tôi, từ hệ thống lọc nhỏ trong phòng thí nghiệm sử dụng một lần đến hệ thống lọc sản xuất, kiểm tra độ vô trùng, lên men, nuôi cấy tế bào, v.v., đều đáp ứng nhu cầu thử nghiệm và sản xuất. Guidling Technology rất mong được hợp tác cùng các bạn!